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Identifizierung von Indocyaningrün als STT3B-Inhibitor gegen die Zytotoxizität von Pilz-α-Amanitin

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Bei Wang, Arabella H. Wan, Yu Xu, Ruo-Xin Zhang, Ben-Chi Zhao, Xin-Yuan Zhao, Yan-Chuan Shi, Xiaolei Zhang, Yongbo Xue, Yong Luo, Yinyue Deng, G. Gregory Neely, Guohui Wan & Qiao-Ping Wang

Abstrakt

Der „Todespilz“, Amanita phalloides, ist der giftigste Pilz der Welt und für 90 % der durch Pilze verursachten Todesfälle verantwortlich. Der tödlichste Bestandteil des Knollenblätterpilzes ist α-Amanitin. Trotz seiner tödlichen Wirkung bleiben die genauen Mechanismen, wie α-Amanitin den Menschen vergiftet, unklar, so daß kein spezifisches Gegenmittel für die Behandlung verfügbar ist. Hier wird gezeigr, daß STT3B für die α-Amanitin-Toxizität erforderlich ist und sein Inhibitor Indocyaningrün (ICG) als spezifisches Gegenmittel verwendet werden kann. Durch die Kombination eines genomweiten CRISPR-Screenings mit einem In-silico-Wirkstoffscreening und einer In-vivo-Funktionsvalidierung entdeckte das Forscherteam, daß der N-Glykan-Biosyntheseweg und seine Schlüsselkomponente STT3B eine entscheidende Rolle bei der α-Amanitin-Toxizität spielen und dass ICG ein STT3B Inhibitor ist.

Darüber hinaus zeigten die Ergebisse, daß ICG die toxische Wirkung von α-Amanitin in Zellen, Leberorganoiden und männlichen Mäusen wirksam blockiert, was zu einer Gesamtüberlebenssteigerung der Tiere führt. Durch die Kombination eines genomweiten CRISPR-Screenings auf α-Amanitin-Toxizität mit einem In-silico-Arzneimittelscreening und einer funktionellen Validierung in vivo hebt die Studie ICG als STT3B-Inhibitor gegen das Pilztoxin hervor.

Einführung

Pilzvergiftungen sind weltweit die Haupttodesursache bei Lebensmittelvergiftungen. Zwischen 2010 und 2020 wurden in China insgesamt 10.036 Expositionsereignisse gemeldet, die zu 38.676 Erkrankungen und 788 Todesfällen führten. Unter allen giftigen Pilzen sind Knollenblätterpilze (Amanita phalloides) für mehr als 90 % aller Todesfälle verantwortlich. Eine Amatoxinvergiftung ist häufig mit schlechten Ausgang verbunden, hauptsächlich aufgrund des irreparablen akuten Versagens der Leber oder der Niere.

α-Amanitin (AMA) ist eines der giftigsten Amatoxine. Es wird angenommen, daß die toxischen Wirkungen von AMA auf den Menschen mit der Hemmung der RNA-Polymerase II (RNAP II) verbunden sind, was zur Produktion von Tumornekrosefaktor-α (TNFα)8, oxidativem Stress9 und Apoptose führt. Traditionelle Therapien beschränken sich oft auf die unspezifische Neutralisierung von Toxinen sowie symptomatische und unterstützende Pflege.

In den letzten Jahrzehnten haben mehrere klinische Medikamente, darunter Silybin und Penicillin, eine starke therapeutische Wirksamkeit bei menschlichen Amatoxinvergiftungen gezeigt, obwohl die genauen Wirkmechanismen unklar bleiben. Darüber hinaus wurde gezeigt, daß Polymyxin B, das in einem virtuellen Docking als potenzieller RNAP-II-Inhibitor identifiziert wurde, die AMA-Toxizität bei Mäusen blockiert. Spezifische Gegenmittel, die auf bestimmte Proteine abzielen, die eine entscheidende Rolle bei der AMA-Toxizität spielen, sind jedoch nicht verfügbar, da ein vollständiges molekulares Verständnis der AMA-Zytotoxizität fehlt.

Kürzlich haben CRISPR-Screenings (Pooled Clustered Regular Interspaced Short Palindromic Repeats) das molekulare Verständnis der molekularen Mechanismen, die den Zelltod steuern, beschleunigt. Diese Hochdurchsatz-CRISPR-Screenings wurden häufig zur Identifizierung von Genen oder Signalwegen eingesetzt, die an Arzneimittelresistenzen, Mechanismen von Bakterientoxinen oder Virusinfektionen beteiligt sind. Darüber hinaus haben die Wissenschaftler diesen Ansatz genutzt, um die molekularen Mechanismen des tödlichen Quallengifts zu analysieren, was zu einem wirksamen Gegenmittel gegen die Quallentoxizität führte.

In dieser Studie soll ein systematischenr Rahmen für die Entwicklung von Gegenmitteln geschaffen werden, indem die Identifizierung neuer Wirkstoffziele mithilfe eines genomweiten CRISPR-Screenings und eines virtuellen Screenings von FDA-zugelassenen Medikamenten kombiniert wird. Die Wissenschaftler führten zunächst ein genomweites CRISPR-Funktionsverlust-Screening durch, um Gene und Signalwege zu identifizieren, die an der AMA-Zytotoxizität beteiligt sind. Sie fanden heraus, daß mehrere neuartige Wege, einschließlich der N-Glykan-Biosynthese und des Cholesterinstoffwechsels, am AMA-induzierten Zelltod beteiligt sind. Es wurde außerdem dargestellt, daß die N-Glykan-Biosynthese und sein katalytisches Enzym STT3B für die AMA-Toxizität erforderlich sind. Durch die Kombination dieser Daten mit einem In-silico-Screening von FDA-zugelassenen Arzneimitteln und einer anschließenden Funktionsvalidierung konnten die Forscher ICG erfolgreich als potenziellen STT3B-Inhibitor identifizieren. Sie haben außerdem gezeigt, daß ICG den AMA-induzierten Zelltod in vivo und in vitro blockieren kann, was darauf hindeutet, daß ICG bei der Behandlung von AMA/Todeskappenvergiftungen nützlich sein könnte.

Ergebnisse

Ein Hochdurchsatz-CRISPR-Screening zur Identifizierung von Genen und Signalwegen, die für den AMA-induzierten Zelltod erforderlich sind

Amanita phalloides ist eine häufige Todesursache bei Lebensmittelvergiftungen, vor allem aufgrund der Produktion von AMA26 (Abb. 1a). Um die Schlüsselgene und -wege zu identifizieren, die für den AMA-induzierten Zelltod erforderlich sind, führte das Forscherteam unter Verwendung der gepoolten menschlichen CRISPR-Knockout-Bibliothek (Brunello) ein genomweites Funktionsverlust-Screening durch, das auf insgesamt 19.114 Gene abzielt. Sie haben ihr Screening mit der haploiden Zelllinie HAP1 durchgeführt, die ausgiebig zur Untersuchung der Mechanismen der Arzneimittelresistenz, der Toxikologie, der synthetischen Letalität und der Virusinfektion eingesetzt wurde. Vor dem Screening haben sie zunächst die 50-prozentige Hemmkonzentration (IC50) von AMA bestimmt HAP1-Zellen (Abb. 1b).

Anschließend haben sie HAP1-Zellen mit der Brunello-Bibliothek bei einer niedrigen Infektionsmultiplizität (MOI ≈ 0,3) transduziert, um sicherzustellen, dass die meisten HAP1-Zellen nur eine genetische Störung erfahren (Abb. 1c). Mittlerweile wurde die Abdeckung von >500 Zellen sichergestellt, die jeweils 77.441 sgRNA exprimieren. Transfizierte Zellen wurden dann 7 Tage lang mit 1 μg/ml Puromycin selektiert. Anschließend wurden mutierte Zellpools 7 Tage lang einer Dosis von 1,5 μM AMA ausgesetzt und die genomische DNA wurde aus den überlebenden Zellen zur Tiefensequenzierung extrahiert.

Nach einer modellbasierten Analyse der genomweiten CRISPR/Cas9-Knockout-Analyse (MAGeCK) haben sie Hunderte von Genen identifiziert, die mit dem AMA-induzierten Zelltod assoziiert sind (Abb. 2a, b, Ergänzende Daten 1). Eine Untergruppe von sgRNAs, die auf 559 Gene abzielen, war in den mit AMA behandelten Zellen im Vergleich zu den unbehandelten Kontrollen signifikant verändert (p < 0,05 und |LFC | > 1), was darauf hinweist, daß diese Gene an der AMA-Toxizität beteiligt waren (Abb. 2c).

Die Forscher haben zunächst die bioinformatischen Analysen der Genontologie (GO) und KEGG an diesen veränderten Genen durchgeführt. Wie erwartet war „Regulation der Transkription vom RNA-Polymerase-II-Promotor“ am stärksten im biologischen Prozess angereichert (Abb. 2d), und „RNA-Polymerase-II-Transkriptionsfaktor-Aktivitätssequenzspezifische DNA-Bindung“ war auch am stärksten in der molekularen Funktion angereichert Klassifikator (Abb. 2e). Dies steht im Einklang mit dem bisherigen Verständnis, daß AMA durch Hemmung der RNA-Polymerase II31 wirkt. Mehrere KEGG-Wege, einschließlich Apoptose, N-Glykan-Biosynthese und Cholesterinstoffwechsel, wurden ebenfalls durch AMA-induzierten Zelltod angereichert (Abb. 2f).

Das Forscherteam verwendete außerdem einen Netzwerkausbreitungsansatz, um das Gennetzwerk zwischen diesen angereicherten KEGG-Pfaden besser zu verstehen (Abb. 2g). Unter diesen angereicherten Prozessen oder Signalwegen wurden die Transkription und Apoptose der RNA-Polymerase II und die Apoptose10,32 mit der AMA-Toxizität in Verbindung gebracht, über die N-Glykan-Biosynthese und den Cholesterinstoffwechsel wurde jedoch noch nicht berichtet, was darauf hindeutet, daß diese beiden Signalwege eine entscheidende Rolle bei der AMA-Toxizität spielen könnten. Gemeinsam hat das Screening neue Wege identifiziert, die für den AMA-induzierten Zelltod erforderlich sind.

Für den AMA-induzierten Zelltod ist die N-Glykan-Biosynthese erforderlich

Der N-Glykan-Biosyntheseweg ist von besonderem Interesse, da seine Schlüsselkomponenten STT3B und MGAT1 in den Top-10-Genen angereichert waren. N-Glykane auf Glykoproteinen dienen als eine der wichtigsten ko- und posttranslationalen Proteinmodifikationen in eukaryotischen Zellen33 und haben mehrere biologische Funktionen, wie Zelladhäsion, intrazelluläre Signalübertragung, Homöostase und Entzündung34,35. Die N-Glykan-Biosynthese findet im endoplasmatischen Retikulum (ER) und im Golgi-Apparat statt und erfordert eine Reihe von Prozessen, die durch mehrere Enzyme katalysiert werden, darunter ALG10, STT3A/3B, MAN1, MGAT1, MAN2 und MGAT2 (Abb. 3a)36. Wir fanden heraus, daß die Zählungen für sgRNA, die auf ALG10, STT3A/3B, RPN2 und MGAT1 abzielen, in AMA-behandelten Zellen angereichert waren (ergänzende Abbildung 1a – e) und dass STT3B und MGAT1 in den Top-10-Treffern angereichert waren.

Um die Rolle der N-Glykan-Biosynthese beim AMA-induzierten Zelltod zu validieren, verwendeten die Wissenschaftler zunächst Kifunensin (KIF), einen wirksamen Inhibitor kleiner Alkaloide, um die MAN1-Aktivität pharmakologisch zu hemmen und so die Synthese von N-Glykanen zu blockieren37,38. Wie erwartet zeigten KIF-behandelte Zellen eine Resistenz gegen den AMA-induzierten Tod in HAP1-Zellen (Abb. 3b). Wichtig ist, dass KIF auch den Zelltod in HAP1-Zellen hemmte, die 6 Stunden lang mit AMA vorbehandelt wurden (Abb. 3c).

STT3B ist eine vorgelagerte Komponente des N-Glykan-Biosynthesewegs39. STT3B und STT3A bilden den Oligosaccharyltransferase (OST)-Komplex, der die posttranslationale Glykosylierung in ER40,41 katalysiert. Um die Rolle von STT3B bei der AMA-Toxizität weiter zu bestätigen, haben wir mithilfe der CRISPR-Cas9-Technologie STT3B-Knockout-HAP1- und HepG2-Zelllinien generiert. Dementsprechend war die STT3B-mRNA-Expression in beiden Zellen stark reduziert (ergänzende Abbildung 2a, b). Die Abreicherung von STT3B führte zu einer erhöhten Resistenz gegen AMA-induzierten Zelltod in HAP1-Zellen (Abb. 3d) und HepG2-Zellen (Abb. 3e).

Das Forscherteam hat diese Ergebnisse in HepG2-Zellen mit STT3B-Knockdown unter Verwendung von Short-Hairpin-RNA (shRNA) weiter bestätigt (ergänzende Abbildung 2c). Da STT3B bei der Proteinglykosylierung mit STT3A zusammenarbeitet, fragten sie sich, ob die Abreicherung von STT3A in STT3B-Knockout-Zellen zu einer stärkeren Resistenz gegen AMA-Zytotoxizität führen könnte. Als STT3A in STT3B-Knockout-HepG2-Zellen ausgeschaltet wurde, erlangten diese Zellen eine nahezu vollständige Resistenz gegen den AMA-induzierten Zelltod (ergänzende Abbildung 2d-e), was darauf hindeutet, dass die teilweise Resistenz von STT3B-Knockout-HepG2 gegen AMA auf die Expression von STT3A zurückzuführen war OST-Komplex, der funktionell redundant zum STT3B OST-Komplex40 ist.

Darüber hinaus verwendeten sie einen niedermolekularen N-verknüpften Glykosylierungsinhibitor 1 (NGI-1), um die Aktivität von OST42,43 zu blockieren. NGI-1 kann den AMA-induzierten Zelltod bei 2,5 μM hemmen. NGI-1 selbst war jedoch bei 5–20 μM toxisch für Zellen (ergänzende Abbildung 2f), was darauf hindeutet, dass NGI-1 nicht als Gegenmittel zur AMA-Toxizität verwendet werden konnte . Als nächstes fragten sie sich, ob die Glykanbiosynthese den Eintritt von AMA in Zellen beeinflusst. Der intrazelluläre AMA-Gehalt wurde mit einem etablierten Hochleistungsflüssigkeitschromatographietest (HPLC) quantifiziert (ergänzende Abbildung 3). Die Abreicherung von STT3B verringerte den Eintritt von AMA in HAP1-Zellen (Abb. 3f) und HepG2-Zellen (Abb. 3g) signifikant.

Unterdessen hat STT3B-Knockout keinen Einfluss auf die Expression von OATP1B3 und NTCP, die AMA-Transporter in diesen Zellen sind (Abb. 3h, i). Die Hemmung der Glykosylierung kann Stressreaktionen im Endoplasmatischen Reticulum und im Golgi-Apparat auslösen 44, 45, 46. Der STT3B-Knockout löste jedoch weder im ER noch im Golgi Stressreaktionen aus (ergänzende Abbildung 4). Zusammengenommen deuten alle Daten darauf hin, daß STT3B für den AMA-induzierten Zelltod erforderlich ist und den Eintritt von AMA in Zellen beeinflusst. In-silico-Screening von FDA-zugelassenen Molekülen für den STT3B-Inhibitor: Da die Blockierung der N-Glykan-Biosynthese den AMA-induzierten Zelltod verhindern kann, wären die STT3B-Inhibitoren potenzielle Gegenmittel zur Behandlung der AMA-Toxizität. Bisher wurde über kein von der FDA zugelassenes Molekül berichtet, das STT3B spezifisch hemmt. Daher führten die Wissenschaftlerr ein In-silico-Screening von von der FDA zugelassenen Molekülen durch, um nach potenziellen STT3B-Inhibitoren zu suchen.

Für das virtuelle Screening auf STT3B-Inhibitoren wurden die FDA-Molekülbibliotheken (ZINC und Drugbank) mit insgesamt 3201 Verbindungen verwendet. In STT3B gab es zwei mutmaßliche Bindungstaschen. Nach dem In-silico-Screening wurden insgesamt die 34 besten Verbindungen für die zelluläre In-vitro-Validierung ausgewählt (Abb. 4a, Zusatzdaten 2). Aufgrund der Nichtverfügbarkeit einiger Verbindungen wurden nur 24 Verbindungen auf ihren zellulären Schutz gegen AMA-Toxizität getestet. Von allen getesteten Medikamenten konnten ICG und Posaconazol den Zelltod in HAP1-Zellen signifikant verhindern (Abb. 4b), ohne dass die Zellen zusätzlich zytotoxisch wirkten (Abb. 4c). ICG bot nahezu vollständigen Schutz gegen die AMA-Zytotoxizität.

Beim molekularen Andocken bindet ICG an STT3B und blockiert möglicherweise die katalytische Aktivität. ICG hat mehrere Kontakte mit STT3B (Abb. 4d, e), einschließlich der drei Sauerstoffatome von zwei Sulfobutyleinheiten, die drei Wasserstoffbrückenbindungen mit Seitenketten von Ser319, Trp380 und Ser449 gebildet haben. Darüber hinaus beteiligte sich der Benzolring der Benzoindolyleinheit in ICG an einem versetzten Face-to-Face-Pi-Stapel mit der Seitenkette von Trp380 in STT3B. Die hemmende Wirkung von ICG wird durch die Besetzung des Eingangs der STT3B-Substratbindungstasche vermittelt.

ICG lindert die AMA-Toxizität in Zellen und Leberorganoiden

ICG, ein fluoreszierender Jodidfarbstoff, ist seit 1956 von der FDA als diagnostisches Reagenz beim Menschen zugelassen und wird heute häufig in der Augenangiographie und der Beurteilung der Leberfunktion eingesetzt47. ICG kann schnell von Hepatozyten abgebaut werden47 und ICG hat bei einer Standard-Einzeldosis von 0,5 mg/kg keine offensichtlichen Nebenwirkungen (50 % tödliche Dosis beträgt 60-80 mg/kg für Mäuse)48. Daher haben die Forscher die therapeutische Wirkung von ICG auf die AMA-Toxizität weiter untersucht.

Die ICG-Vorbehandlung führte zu einer dosisabhängigen Verringerung des Zelltods sowohl in HAP1-Zellen (Abb. 4f) als auch in HepG2-Zellen (Abb. 4g). Darüber hinaus hemmten ICG-Behandlungen auch den Zelltod in AMA-vorbehandelten HAP1-Zellen (Abb. 4h) und HepG2-Zellen (Abb. 4i) signifikant. Um weiter zu bestätigen, daß ICG die AMA-Toxizität blockieren kann, überwachte das Forscherteam den Zelltod mithilfe der Calcein/Propidiumiodid (PI)-Färbung und stellte erneut fest, daß mit ICG vorbehandelte Zellen viel resistenter gegen den AMA-induzierten Zelltod waren (Abb. 4j, k).

Darüber hinaus haben sie ein Mausleber-Organoidmodell zur weiteren Bewertung der therapeutischen Wirkung von ICG erstellt. In Übereinstimmung mit ihren Beobachtungen in HAP1- und HepG2-Zellen könnte ICG die zytotoxische Wirkung von AMA auf diese Leberorganoide wirksam blockieren.

Mit ICG behandelte Organoide waren enger verbunden und größer als die mit Vehikel behandelten Organoide (Abb. 5a, b). Wir beobachteten auch, dass die ICG-Behandlung den AMA-induzierten Zelltod durch den Calcein/PI-Färbetest signifikant verhinderte (Abb. 5c). Der ICG-Behandlungseffekt wurde auch durch Hämatoxylin- und Eosin-Färbung (H&E) beobachtet und ICG blockierte die AMA-Toxizität auf Organoiden (Abb. 5d). Zusammengenommen ist die Kombination des funktionellen CRISPR-Screenings mit der In-silico-Arzneimittelvorhersage eine praktikable Pipeline zur schnellen Identifizierung neuer Toxin-Gegenmittel. Hier zeigen die Forscher, daß ICG ein potenzieller STT3B-Inhibitor ist, der den AMA-induzierten Zelltod verhindern kann.

ICG verhindert den AMA-induzierten Zelltod, indem es die STT3B-Aktivität hemmt Um zu testen, ob ICG mit STT3B in Zellen interagieren kann, wurde die intrazelluläre Lokalisierung von ICG nachgewiesen. ICG kann grüne Fluoreszenz erzeugen. Es wurde heraus gefunden, daß ICG in HAP1-Zellen zusammen mit ER lokalisiert war, und diese Kolokalisation wurde in HepG2-Zellen bestätigt (Abb. 6a), was darauf hindeutet, daß ICG im ER wirkt, wo auch STT3B lokalisiert ist.

Um weiter zu testen, ob ICG die STT3B-Aktivität hemmen kann, verwendete das Wissenschaftsteam einen Biolumineszenz-Reporter, nämlich ER-LucT, um die STT3B-Aktivität durch ein ER-LucT-Reportersystem zu bewerten42,43. Dieses System besteht aus einer modifizierten Luciferase (Luc) mit einer ER-Translationssequenz und drei (T) potenziellen Glykosylierungsstellen49. Die N-Glykosylierung der modifizierten Luciferase hemmt deren Aktivität und reduziert die Biolumineszenz (Abb. 6b).

Das ER-LucT-Reportersystem wurde zunächst in HAP1-Zellen getestet. Die Lumineszenz war in Zellen mit ER-LucT signifikant verringert, was darauf hindeutet, daß die Luciferase-Aktivität gehemmt war (Abb. 6c). Wie erwartet erhöhte ICG im Einklang mit NGI-1 (ergänzende Abbildung 5a) die Aktivität von ER-LucT, indem es die durch STT3B vermittelte N-Glykosylierung verringerte (Abb. 6d). Ähnliche Ergebnisse wurden auch in HepG2-Zellen beobachtet (Abb. 6e, f, ergänzende Abb. 5b). Zusammen verhindert ICG den AMA-induzierten Zelltod der Zellen, indem es die STT3B-Aktivität hemmt.

ICG ist ein wirksames Gegenmittel zur Behandlung der AMA-Toxizität bei Mäusen Als nächstes testeten die Forscher die Wirksamkeit von ICG als AMA-Gegenmittel an Tieren. Um die tatsächliche AMA-Toxizität beim Menschen nachzuahmen50,51, wurde ICG Mäusen verabreicht, die wie zuvor berichtet 4 Stunden lang mit intraperitonealem (i.p.) AMA mit 0,33 mg/kg vorbehandelt wurden5,52.

Drei aufeinanderfolgende Verabreichungen von ICG in einer Menge von 5 mg/kg, was etwa 0,5 mg/kg beim Menschen entspricht53, wurden Mäusen im Abstand von 4 Stunden intravenös (iv) injiziert (Abb. 7a). Die ICG-Verteilung wurde durch Nahinfrarot (NIR)54 überwacht. Nach der Injektion verteilte sich ICG schnell im ganzen Körper und konzentrierte sich nach 2 Stunden hauptsächlich in der Leber (Abb. 7b), was mit früheren Beobachtungen übereinstimmt, daß ICG schnell aus dem Plasma entfernt und selektiv von der Leber aufgenommen wird55.

Da Leber und Niere die wichtigsten AMA-Zielorgane sind, wurde die schützende Wirkung von ICG auf die AMA-exponierte Leber und Niere untersucht. Die Schäden in Leber und Niere wurden durch Messung von Plasma-Biomarkern und histopathologischen Analysen bewertet. Nach der AMA-Behandlung waren die Leberbiomarker Aspartataminotransferase (AST), Alaninaminotransferase (ALT) und alkalische Phosphatase (ALP) signifikant erhöht (Abb. 7c, d, f) und das AST/ALT-Verhältnis war deutlich verringert (Abb. 7e).

Dies deutet darauf hin, daß die Leber durch AMA schwer geschädigt wurde. Wichtig ist, daß die ICG-Behandlung die AST-, ALT- und ALP-Spiegel deutlich senkte, was darauf hindeutet, daß ICG den durch AMA verursachten Leberschaden blockieren kann (Abb. 7c–f). Ähnliche Ergebnisse wurden für die Nieren beobachtet, wobei die ICG-Behandlung die renalen Biomarker Blut-Harnstoff-Stickstoff (BUN) und Kreatinin (Cre) bei den mit AMA behandelten Mäusen signifikant reduzierte (Abb. 7g, h).

Die ICG-Behandlung reduzierte auch die Infiltration entzündlicher Zellen und die Nekrose in der Leber von AMA-behandelten Mäusen erheblich (Abb. 7i). Diese Daten wurden quantifiziert und histologische Ergebnisse bestätigten, dass ICG die AMA-induzierte Lebernekrose unterdrücken kann (Abb. 7j), und ähnliche Ergebnisse wurden für mit AMA und ICG behandelte Nieren beobachtet (Abb. 7i, k).

Darüber hinaus führten die Wissenschaftler einen Langzeitüberlebenstest (30 Tage) durch, um zu bewerten, ob ICG auch vor dem durch AMA verursachten Tod schützen kann. Dabei stellten sie fest, daß die ICG-Behandlung das Überleben von mit AMA behandelten Mäusen signifikant verbesserte (Abb. 7l). Darüber hinaus beobachteten sie weder in Kurz- noch in Langzeitstudien offensichtliche Nebenwirkungen bei Mäusen, die nur ICG erhielten, was zeigt, daß diese ICG-Dosis für die Behandlung einer AMA-Vergiftung bei Mäusen sicher ist.

Es wuden auch längere Zeitintervalle (bis zu 12 Stunden) zwischen der AMA-Injektion und der ICG-Behandlung in einem Mausmodell untersucht. Die Ergebnisse zeigten, daß die Zeitintervalle zwischen der AMA-Injektion und der ICG-Verabreichung wichtig für den ICG-Behandlungseffekt waren. Die Intervalle von 8 h und 12 h begrenzten den ICG-Behandlungseffekt, und Intervalle von 1 h und 4 h hatten eine bessere therapeutische Wirksamkeit (ergänzende Abbildung 6). Dies weist darauf hin, daß ICG so früh wie möglich verabreicht werden muss, wenn eine AMA-Vergiftung auftritt.

Um die hemmende Wirkung von ICG auf die Proteinglycansynthese bei Tieren zu testen, führte das Team eine Lektinfärbung durch, um die In-vivo-Glykation zu beurteilen. Sie verwendeten Fluorescein-Sambucus-Nigra-Agglutinin (SNA) und Fluorescein-Phaseolus-vulgaris-Leukoagglutinin (PHA-L), um sialylierte Glykane bzw. komplexe Glykane anzufärben, wie bereits berichtet56. Wie erwartet können SNA und PHA-L die glykierten Proteine markieren, die sich auf der Plasmamembran von Leberzellen befinden.

ICG könnte die Fluoreszenzen der SNA- (Abb. 8a, b) und PHA-L-Färbung (Abb. 8c, d) im Vergleich zum Vehikel deutlich reduzieren, was darauf hindeutet, daß ICG die Glykation in vivo effektiv stören könnte. Zusammengenommen zeigen diese Daten, daß ICG ein wirksames Gegenmittel zur Behandlung der AMA-Toxizität bei Mäusen ist.

Diskussion

Unser unvoreingenommenes genomweites CRISPR-Screening hat ergeben, daß sowohl STT3B- als auch die N-Glykan-Biosynthesewege für die AMA-Toxizität erforderlich sind, und diese Daten wurden sowohl genetisch als auch pharmakologisch validiert. Darüber hinaus haben die Forscher durch die Kombination unseres CRISPR-Screenings mit dem In-silico-Screening arzneimittelfähiger Ziele eine von der FDA zugelassene Verbindung ICG entdeckt, die als neuartiges potenzielles Gegenmittel zur Linderung der AMA-Toxizität sowohl in Zellen als auch bei Tieren dienen könnte (Abb. 9). Die gewonnenen Ergebnisse zeigen, daß ein kombinierter Ansatz aus genomweitem CRISPR-Screening in Verbindung mit der In-silico-Arzneimittelvorhersage dabei helfen kann, schnell neue Gegenmittel für medizinisch relevante menschliche Gifte zu identifizieren.

Da der Verzehr von Knollenblätterpilz (Amanita phalloides) zu einer hohen Sterblichkeitsrate führt, besteht ein dringender Bedarf, die molekulare Toxikologie seines wichtigsten toxischen Bestandteils AMA besser zu verstehen. Dies erleichtert somit die Entdeckung wirksamer Gegenmittel zur Behandlung von Pilzvergiftungen.

Mithilfe eines genomweiten CRISPR-Cas9-Screenings haben wir mehrere wichtige Gene und Signalwege identifiziert, die am AMA-induzierten Zelltod beteiligt sind. Um die Fähigkeit des Screenings zur Identifizierung von Schlüsselfaktoren zu unterstützen, gehörten einige der bekannten Mechanismen, die an der AMA-Toxizität beteiligt sind, wie Apoptose und RNA-Polymerase-II-Hemmung, zu den Signalwegen und GO-Begriffen. Einer unserer wichtigsten Wege, die N-Glykan-Biosynthese, wurde sowohl pharmakologisch als auch genetisch validiert. Die N-verknüpfte Glykosylierung spielt eine entscheidende Rolle bei der Proteinfaltung und dem Proteintransport, die an einer Vielzahl biologischer Erkennungsereignisse beteiligt sind34.

Es wurde berichtet, daß bakterielle Toxine37,57 und Viren23,58 N-Glykane binden und diese Wechselwirkung den Eintritt in Zielzellen erleichtert. In diesem Fall stellten wir die Hypothese auf, dass die Blockierung von N-Glykanen von AMA-Transportern die Erkennung von AMA behindern könnte, was zur Resistenz beiträgt. STT3B ist ein Schlüsselenzym für die N-Glykan-Biosynthese und gilt als therapeutisches Ziel für die Behandlung von Krebserkrankungen42. Es wurde jedoch keine von der FDA zugelassene Verbindung zur Hemmung der N-Glykan-Biosynthese oder von STT3B identifiziert. Durch In-silico-Screening von FDA-zugelassenen Molekülen konnten die Forscher erfolgreich nachweisen, daß ICG ein potenzieller STT3B-Inhibitor zur Hemmung der N-Glykan-Biosynthese ist. ICG ist ein wasserlöslicher Nahinfrarot-Fluoreszenzfarbstoff, der seit Jahrzehnten häufig als Diagnosemittel zur Messung der Leberfunktion, des Herzzeitvolumens und der Augenangiographie beim Menschen eingesetzt wird59,60.

Es hat sich herausgestellt, daß ICG den AMA-induzierten Zelltod wirksam verhindern und die Resistenz gegen AMA in vitro erhöhen kann. Der enterohepatische Zyklus von AMA könnte den klinischen Verlauf einer Amatoxinvergiftung bei Menschen und Tieren erheblich beeinflussen61. Die Unterbrechung des enterohepatischen Kreislaufs wie die Gallendrainage ist zu einer alternativen Entgiftungsmethode geworden62. Da ICG den Eintritt von AMA verhindern kann, kann ICG die AMA-Rezirkulation blockieren und die AMA-Toxizität verhindern, was teilweise die therapeutische Wirkung von ICG erklärt.

HepG2-Zellen wurden zur Untersuchung der Hepatotoxizität63 und der molekularen Mechanismen der AMA-Zytotoxizität7 verwendet. HepG2-Zellen zeigen eine relativ geringe Expression von OATP1B364 und exprimieren kein NTCP65, während diese beiden Proteine als Haupttransporter für die AMA-Aufnahme gelten. Daher weisen HepG2-Zellen im Vergleich zu anderen gängigen Laborzelllinien oder primären Hepatozyten eine geringere Empfindlichkeit gegenüber AMA-Zytotoxizität auf66. Dennoch können in unserer Studie HepG2-Zellen immer noch durch AMA abgetötet und durch ICG gerettet werden, was darauf hindeutet, daß es unbekannte Transporter gibt, die für den AMA-Transport in Zellen verantwortlich sind.

Interessanterweise wurde ICG auch durch OATP1B3 und NTCP67 in Zellen transportiert. Unsere Ergebnisse schließen die Möglichkeit aus, dass ICG hauptsächlich durch kompetitive Bindung mit OATP1B3 und NTCP wirkt, um die Toxizität von AMA zu blockieren. Darüber hinaus zeigte unsere Studie, dass ICG ähnliche Schutzwirkungen in AMA-behandelten primären Hepatozyten-Organoiden hat. In dieser Studie haben die Wissenschaftler sich auf das 4-Stunden-Intervall zwischen der AMA-Injektion und der ICG-Behandlung konzentriert, da dieses 4-Stunden-Intervall das gleiche war wie das, das in früheren Studien verwendet wurde, um tatsächliche Vergiftungs- und Behandlungsszenarien beim Menschen nachzuahmen5,52,68.

Dies wird es zukünftig erleichtern, die gewonnenen Ergebnisse mit denen anderer hinsichtlich der Wirksamkeit von ICG bei der Behandlung von AMA-Toxizität zu vergleichen. ICG hat ein großes Potenzial für die Behandlung von AMA-Vergiftungen bei Mäusen gezeigt und die ICG-Behandlung kann AMA-induzierte Schäden in Leber und Niere, den beiden wichtigsten AMA-Zielorganen, erheblich abschwächen, was zu einer Verbesserung des Überlebens führt. Darüber hinaus wurde beobachtet, daß ICG seine Behandlungswirkung auf die AMA-Toxizität verliert, wenn es 8 und 12 Stunden nach der AMA-Injektion verabreicht wird.

Dies kann daran liegen, daß AMA in den ersten Stunden der Zytotoxizität irreversible Schäden verursacht hat, die durch eine ICG-Behandlung nicht behoben werden können. Dies legt nahe, daß ICG so früh wie möglich während der Behandlung verabreicht werden sollte. Insgesamt zeigte sich, daß durch die Kopplung der funktionellen genomischen Charakterisierung des gesamten Genoms mit der In-silico-Arzneimittelvorhersage schnell medizinisch relevante Prozesse definieren lassen und dann gezielt darauf abzielen können.

Ethische Aussage

Alle Tierversuche wurden vom Institutional Animal Care and Use Committee (IACUS) der Sun Yat-Sen-Universität genehmigt (Genehmigungsnummer: SYSU-IACUC-2022-000469).

Zelllinien und Zellkultur

HAP1-Zellen wurden von Horizon Discovery erhalten. HEK293T- und HepG2-Zelllinien wurden von der American Type Culture Collection (ATCC) erhalten. Alle Zelllinien wurden routinemäßig mit dem Mycoplasma Stain Assay Kit (#C0296, Beyotime) mykoplasmenfrei getestet und durch Short Tandem Repeat (STR)-Profiling authentifiziert. HAP1-Zellen wurden in Iscoves modifiziertem Dulbecco-Medium (IMDM; Gibco), ergänzt mit 10 % fötalem Rinderserum (FBS; NEWZERUM) und 1 % Penicillin-Streptomycin (Hyclone), kultiviert. HEK293T- und HepG2-Zellen wurden in Dulbeccos modifiziertem Eagle-Medium (DMEM, Gibco), ergänzt mit 10 % FBS und 1 % Penicillin-Streptomycin, kultiviert.

Zelllebensfähigkeitstest

Trypsinisierte Zellen (1,5 × 104) wurden in jede Vertiefung einer Platte mit 96 Vertiefungen ausgesät. Nach 24 Stunden wurden verschiedene Konzentrationen der Verbindungen hinzugefügt und die Zellen wurden weitere 48 oder 72 Stunden lang inkubiert. KIF (#K919109) und NGI-1 (#N873007) wurden von Macklin erhalten. Nach der Inkubation wurde das Medium aus jeder Vertiefung abgesaugt und 100 μl frisches Medium, das ein 10 %iges Cell Counting Kit-8 (CCK8, #K1018, APExBIO) enthielt, in die Vertiefungen gegeben und 2 Stunden lang bei 37 °C inkubiert.

Die Absorption wurde bei 450 nm mit einem Mikroplatten-Spektrophotometer (BioTek) gemessen. Die Zellüberlebensdaten jeder medikamentös behandelten Gruppe wurden auf die Vehikelgruppe normalisiert und die Überlebensdaten als „relative Zelllebensfähigkeit“ ausgedrückt. Die Lebensfähigkeit von Calcein/PI-Zellen wurde gemäß dem Protokoll des Herstellers (#C2015M, Beyotime) bewertet und unter Fluoreszenzmikroskopie (Nikon) beobachtet.

Lentivirus-Produktion

Um Lentivirus zu erzeugen, wurde die Brunello-Bibliothek (#73179, Addgene) mit den Verpackungsplasmiden pMD2.G (#12259, Addgene) und psPAX2 (#12260, Addgene) co-transfiziert. Kurz gesagt wurde ein T75-Kolben mit 80 % konfluenten HEK293T-Zellen in Opti-MEM (#31985070, Gibco) unter Verwendung von 8,8 μg der lentiCRISPRv2-Plasmidbibliothek, 4,4 μg pMD2.G, 6,7 μg psPAX2 und 32 μL Lipo8000TM (#C0) transfiziert 533 , Beyotime). Die Zellen wurden 8 Stunden lang inkubiert und dann wurde das Medium durch DMEM mit 10 % FBS und 1 % Penicillin-Streptomycin ersetzt. Das Virus wurde 48 Stunden nach der Transfektion geerntet, das Medium wurde aufgefüllt und eine zweite Ernte erfolgte 72 Stunden nach der Transfektion. Virusüberstände wurden gesammelt und durch einen 0,45-μm-Filter mit extrem geringer Proteinbindung (Merck Millipore) filtriert. Aliquote wurden bei –80 °C gelagert.

Zelltransduktion mithilfe der Brunello-Bibliothek

Infektionen wurden in einer 12-Well-Platte mit 2,0 × 106 Zellen pro Well durchgeführt. In jede Vertiefung wurden unterschiedliche Virenmengen gegeben. Nach 24 Stunden wurden die Zellen trypsiniert und jede Vertiefung in zwei Vertiefungen aufgeteilt. Und ein Replikat wurde 3 Tage lang mit 1 μg/ml Puromycin (#P8230, Solarbio) behandelt, bis unter Bedingungen ohne Virus keine lebensfähigen Zellen mehr vorhanden waren. Abschließend wurde die Lebensfähigkeit der Zellen für jede Bedingung mithilfe eines CCK8-Assays quantifiziert. Das Virusvolumen mit einem MOI von etwa 0,3 wurde für das nächste groß angelegte Screening verwendet.

HAP1-Zellen-AMA-Resistenztest

Um die Abdeckung von >500 Zellen sicherzustellen, die jeweils 77.441 sgRNA mit einer MOI ≈ 0,3 exprimieren, wurden 1,3 × 108 HAP1-Zellen wie oben beschrieben unter Verwendung von 12-Well-Platten mit 2 × 106 Zellen pro Well transduziert. Puromycin wurde den Zellen 24 Stunden nach der Transduktion zugesetzt und 7 Tage lang beibehalten. Die Zellen wurden nach 3-tägiger Inkubation mit Puromycin in größeren Flaschen zusammengefasst. Am 7. Tag wurden die Zellen in zweifacher Ausführung in die Behandlungsbedingungen aufgeteilt, mit einem Minimum von 4 × 107 Zellen pro Wiederholung. Zwei Replikate wurden in einem Komplettmedium mit 1,5 μM AMA (#A4548, APExBIO) kultiviert, und zwei weitere Replikate wurden in einem regulären Komplettmedium kultiviert. Es wurden entweder Replikate durchgeführt oder alle 2–3 Tage wurde frisches Medium hinzugefügt. Die mutierten Zellpools wurden 7 Tage lang mit AMA behandelt und die überlebenden Zellen wurden gewonnen und für die genomische DNA-Analyse geerntet.

Genomische DNA-Sequenzierung

Genomische DNA (gDNA) wurde mit TIANamp Genomic DNA Kits (#DP304, TIANGEN) gemäß dem Protokoll des Herstellers isoliert. Die sgRNA-Sequenzen wurden mit High-Fidelity 2X PCR Master Mix (#M0541L, NEB) amplifiziert. PCR-Produkte wurden mit Illumina (PE150) von Novogene Technology (Peking, China) gelextrahiert, quantifiziert, gemischt und sequenziert. Die Anreicherung von sgRNAs und Genen wurde mit MAGeCK (Version 0.5.9.2)69 analysiert, indem die Lesezahlen von Zellen nach der AMA-Selektion mit den Zahlen aus passenden, nicht ausgewählten Zellpopulationen verglichen wurden.

Genontologie (GO) und Signalweganreicherungsanalyse

GO-Begriffe im Bildschirm wurden mit DAVID (https://david.ncifcrf.gov/summary.jsp) analysiert. KEGG-Pfade wurden mit Webgestalt (http://www.webgestalt.org/) analysiert. Anreicherungsnetzwerkpfade wurden mithilfe von String (https://cn.string-db.org/) und Cytoscape (https://cytoscape.org/) generiert.

Etablierung von Knockout-Zelllinien

sgRNAs aus der Elternbibliothek wurden in pLentiCRISPRv2 (# 52961, Addgene) kloniert. Die Kontroll-sgRNA wurde aus der Elternbibliothek verwendet (Ergänzungstabelle 1). Lentiviren wurden wie oben beschrieben hergestellt und transduzierte HAP1- oder HepG2-Zellen wurden 24 Stunden nach der Infektion mit Puromycin selektiert. Nach 7 Tagen wurde Puromycin entfernt und die Zellen konnten sich vor der Analyse drei weitere Tage lang erholen.

RNA-Extraktion und quantitative Echtzeit-PCR-Analyse

Die Gesamt-RNA wurde mit einem RNA Quick Purification Kit (#RN001, YIBIN) extrahiert. Die cDNA wurde aus 500 ng Gesamt-RNA mit PrimeScript RT Master Mix (#RR037A, Takara) gemäß den Anweisungen des Herstellers synthetisiert. Quantitative PCR (qPCR) wurde mit TB Green (#RR820A, Takara) gemäß dem Protokoll des Herstellers mit LightCycler96 (Roche) durchgeführt.

Hochleistungsflüssigkeitschromatographie (HPLC)

Die HPLC-Analyse wurde mit SHIMADZU LC-20AT und einer 250 mm  ×  4,6 mm Flüssigkeitschromatographiesäule (5  μm, Phenomenex) durchgeführt. Ammoniumacetat (50 mM Essigsäure, pH 5,5), Acetonitril und Methanol (80/10/10; v/v/v) wurden nach einer früheren Studie als mobile Phase verwendet70. Eine isokratische Elution wurde mit einer Flussrate von 1,0 ml/min und einer Säulentemperatur von 35 °C durchgeführt. Insgesamt wurden 2 × 107 Zellen, die 8 h lang mit AMA behandelt wurden, gesammelt und dann durch Ultraschallbehandlung bei 200 W (3 s Arbeit/3 s Pause) für 1 min auf Eiswasser aufgebrochen. Diese Mischung wurde 30 Minuten lang bei 15.000 g zentrifugiert. Der Überstand wurde gesammelt und durch einen 0,22-μm-Filter (Merck Millipore) filtriert. Insgesamt wurden 10 μL Probe in das HPLC-System injiziert. Für quantitative Analysen wurden Chromatogramme bei 303 nm integriert. Die Peakfläche wurde mit der LabSolutions-Software (Version 1.26) analysiert.

Western-Blot-Analyse

Die Zellen wurden in einem Lysepuffer (#FD009, Fdbio) geerntet, der einen Proteaseinhibitor-Cocktail (Roche) enthielt. Die gesamten Zelllysate wurden 10 Minuten lang bei 4 °C und 15.000 g zentrifugiert, um Zelltrümmer zu entfernen. Die Proteinkonzentrationen wurden mit dem BCA Protein Assay (#P0010, Beyotime) bestimmt. Die Proteinüberstände wurden mit 5×Ladepuffer (FD006, Fdbio) gemischt und 10 Minuten lang auf 100 °C erhitzt. Die Proteine (20 μg) wurden auf 10 % SDS-Polyacrylamidgelen elektrophoretisch aufgetrennt, auf PVDF-Membranen übertragen und über Nacht bei 4 °C mit spezifischen Primärantikörpern inkubiert. Nach dem Waschen wurden die Membranen 1 Stunde lang mit Meerrettichperoxidase (HRP)-konjugierten Sekundärantikörpern inkubiert. Immunoblots wurden mit dem ChemiDocTM-Bildgebungssystem (Bio-Rad, Version 2.4.0.03) unter Verwendung des verbesserten Chemilumineszenzsubstrats (FD8000, Fdbio) sichtbar gemacht.

Für den Proteinnachweis wurden die folgenden Antikörper verwendet: monoklonaler Maus-Antikörper, der OATP1B3 erkennt (#66381-1-Ig, 1:5000, Klon-Nr. 1D9A4), monoklonaler Maus-Antikörper, der GRP78 erkennt (#66574-1-Ig, 1:5000, Klon-Nr .1D6F7), polyklonaler Kaninchen-Antikörper, der IRE1 erkennt (#27528-1-AP, 1:1000), monoklonaler Maus-Antikörper, der GM130 erkennt (#66662-1-Ig, 1:5000, CloneNo.2A4F11), polyklonaler Kaninchen-Antikörper, der ARF4 erkennt( #11673-1-AP, 1:1000) wurden von Proteintech erworben. Der polyklonale Kaninchen-Antikörper, der NTCP erkennt (#ABP53103, 1:1000), wurde von Abbkine erworben. Der Mausantikörper, der β-Tubulin erkennt (#FD0064, 1:5000), wurde von Fdbio erworben. Ziegen-Anti-Maus-IgG(H + L)-HRP (#BS12478, 1:5000) und Ziegen-Anti-Kaninchen-IgG(H + L)-HRP (#BS13278, 1:5000) wurden von Bioworld gekauft.

In-silico-Screening von FDA-zugelassenen Medikamenten

Die beiden Bibliotheken von FDA-zugelassenen Verbindungen wurden von ZINC (1615 Liganden) bzw. Drugbank (1586 Liganden) heruntergeladen. Die chemische Datenbank wurde mithilfe des MMFF94-Kraftfelds (steilster Abstieg) im Open-Source-Softwarepaket OpenBabel (http://openbabel.org/) energieminimiert und im mol2-Format gespeichert. Die Verbindungsbibliothek wird dann vorverarbeitet und im pdbqt-Format mit Prepare_ligand4.py aus den AutoDock-Tools (https://ccsb.scripps.edu/mgltools/) gespeichert.

Die Kristallstruktur von STT3B wurde aus RCSB PDB (PDB-ID: 6S7T)71 erhalten. Das STT3B wurde von PyMol (http://pymol.org/2/) vorverarbeitet, um Wasser und Liganden zu entfernen, und von AutoDock-Tools, um polare Wasserstoffe und Kollman-Ladung hinzuzufügen. Nach diesen Vorgängen wurde STT3B dann im pdbqt-Format gespeichert. Im STT3B gibt es zwei Bindungstaschen. Das Rasterfeld der Bindungsstelle wurde mithilfe der Rastereinstellungsfunktion der AutoDock-Tools visuell definiert. Die Gitterbox aus zwei Bindungstaschen wurde durch gebundenes Peptid und gebundenes Dolichylphosphat in 6S7T definiert. Für die STT3B-Tasche 1 betrugen die Gittergrößenabmessungen 23,25 × 22,5 × 24, wobei der Punkt (173,747, 153,363, 152,254) als Mittelpunktskoordinaten festgelegt wurde; Für die STT3B-Tasche 2 betrugen die Gittergrößenabmessungen 23,25 × 24,75 × 24,75, wobei der Punkt (159,012, 143,831, 166,532) als Mittelpunktkoordinaten festgelegt wurde.

Der Andockvorgang wurde mit Smina (einem Zweig von AutoDock Vina, https://vina.scripps.edu/)72 durchgeführt. Molekulare Docking-Parameter werden wie folgt verwendet: Vollständigkeit = 8, num_modes = 10, Energiebereich = 3, min_rmsd_filter = 1. Es wurde ein schrittweises Screening von FDA-zugelassenen Arzneimitteln in den ZINC- und Drugbank-Datenbanken durchgeführt. Zunächst wurden die Verbindungen jeweils an die beiden Bindungstaschen von STT3B angedockt. Dann wurden die Verbindungen nach ihrer minimierten Affinität eingestuft. Es wurden die 100 besten Liganden mit minimierter Affinität erhalten. Anschließend wurde der vorhergesagte IC50-Wert der Verbindungen mit der auf einem neuronalen Netzwerk basierenden Bewertungsfunktion (NNScore2)73 berechnet. Am Ende wurden die 34 besten Verbindungen für die In-vitro-Validierung ausgewählt. Aufgrund der Nichtverfügbarkeit einiger Verbindungen wurden nur 24 Verbindungen auf ihren zellulären Schutz gegen AMA-Toxizität getestet.

Organoidkultur

Die Leberorganoide der Mäuse wurden gemäß zuvor beschriebenen Protokollen mit einigen Modifikationen erzeugt74,75. Kurz gesagt, die Lebern von CD-1-Mäusen (20–30 g) wurden in Würfel von 1–2 mm3 zerlegt und zweimal in PBS gewaschen. Die Gewebefragmente wurden in Verdauungspuffer (1 mg/ml Kollagenase I, 0,1 mg/ml Hyaluronidase, 0,1 mg/ml DNase I) 1,5 h lang bei 37 °C inkubiert. Nach der Verdauung wurde die Gewebesuspension mit einem 40-μm-Zellsieb filtriert, anschließend zentrifugiert und mit PBS resuspendiert. Einzelzellsuspensionen wurden zunächst mit hoher Dichte ausgesät und nach etwa einer Woche in vollständigem Organoidmedium (DMEM/F12 mit 5 µg/ml Insulin, 250 µg/ml Amphotericin B, 10 µg/ml Gentamicin, 0,125 µg) mit niedrigerer Dichte erneut ausgesät /ml EGF, 25 ng/ml Hydrocortison und 10 μm Y-27632).

Intrazelluläre Lokalisierungsanalyse

HAP1- und HepG2-Zellen wurden bis zu einer Konfluenz von ~50 % in die Kulturschale ausplattiert und 12 Stunden lang mit ICG (#H20055881, Dandong Pharmaceutical Company) inkubiert. Die Zellen wurden dreimal mit PBS gewaschen und ER wurde gemäß dem Protokoll des Herstellers (#C1042S, Beyotime) mit ER-Tracker-Grün markiert, und der Zellkern wurde mit 4′,6-Diamidino-2-phenylindol (DAPI) blau gefärbt. Fluoreszenzbilder wurden durch konfokale Laser-Scanning-Mikroskopie erhalten.

Luciferase-Reporter-Assay

Die ER-LucT-Sequenz und die LucT-Sequenz aus einer früheren Studie49 wurden von Kidan Bio Co. Ltd. synthetisiert und in pcDNA3.1(+) kloniert. Plasmidtransfektionen wurden mit Lipo8000TM durchgeführt. Nach 48 Stunden wurde ICG zu den transfizierten HAP1- und HepG2-Zellen gegeben. Luciferase-Aktivitätstests wurden mit dem Firefly Luciferase Reporter Gene Assay Kit gemäß dem Protokoll des Herstellers (#RG005, Beyotime) mit dem Lumineszenz Quick Read (Promega) durchgeführt.

Mäuse

Alle Mäuse waren männliche CD-1-Mäuse mit einem Gewicht von 20–30 g (4–5 Wochen alt) und wurden vom Laboratory Animal Center der Sun Yat-Sen-Universität gekauft. Die Mäuse wurden in einer speziellen pathogenfreien Einrichtung mit kontrollierter Temperatur (23 ± 2 °C), Luftfeuchtigkeit (50–65 %) und einem Hell-Dunkel-Zyklus von 12 Std./12 Std. gehalten. Mäuse hatten freien Zugang zu Futter und Wasser.

Körpergewicht, motorische Aktivität, Atemnot und das allgemeine Wohlbefinden der Tiere wurden täglich beobachtet. Die Mäuse wurden gemäß den von der IACUC zugelassenen Anästhesiemethoden mit 1 % Pentobarbital-Natrium und anschließender Zervixluxation eingeschläfert.

Kurzzeitstudie an Mäusen (24 h)

Die Mäuse wurden zufällig in 4 Gruppen verteilt (n = 6) und wie folgt behandelt: (i) Kontrollgruppe (0,9 % NaCl, i.p. bei 0, 4, 8 und 12 Stunden); (ii) ICG-Gruppe (0,9 % NaCl, i.p. bei 0 h; 5 mg/kg ICG, i.v. bei 4, 8 und 12 h); (ii) AMA-Gruppe (0,33 mg/kg AMA i.p. bei 0 h; 0,9 % NaCl, i.v. bei 4, 8 und 12 h); (iii) AMA + ICG-Gruppe, (0,33 mg/kg AMA i.p. bei 0 h; 5 mg/kg ICG i.p. bei 4, 8 und 12 h).

Langzeitstudie an Mäusen (30 Tage)

Die Mäuse wurden zufällig in 4 Gruppen eingeteilt (n = 6) und demselben Verabreichungsprotokoll wie in der Kurzzeitstudie unterzogen. Körpergewicht, motorische Aktivität, Atemnot und allgemeines Wohlbefinden der Tiere wurden 30 Tage lang täglich beobachtet.

In-vivo-Fluoreszenzbildgebung

Insgesamt wurden 5 mg/kg ICG intravenös injiziert und Bilder wurden 0, 10, 20, 40, 60 und 120 Minuten nach der Injektion mit einem In-vivo-Bildgebungssystem (PerkinElmer) aufgenommen.

Blutbiomarker

24 Stunden nach der AMA-Injektion wurden alle Tiere betäubt und eingeschläfert. Das Blut wurde in EDTA-haltige Röhrchen entnommen und sofort 10 Minuten lang bei 3000 g (4 °C) zentrifugiert. Der Plasmaüberstand wurde in Röhrchen gesammelt und bis zur Bestimmung bei –80 °C gelagert. AST, ALT, ALP, BUN und Cre wurden vom Guangdong Engineering & Technology Research Center for Disease-Model Animals der Sun Yat-sen University gemessen.

Histologische Analyse von Leber und Niere

Nach der Blutentnahme wurden Leber und Nieren entnommen und gewogen. Leber- und Nierensegmente wurden zur H&E-Färbung durch Servicebio-Technologie in 4 % Paraformaldehyd gelegt. Der Grad der Entzündung und der Nekrose der Objektträger wurde blind anhand des folgenden Kriteriums halbquantifiziert: Grad 0 = keine Veränderung gegenüber dem Normalwert; Grad 1 = sehr mild (die Veränderungen liegen knapp außerhalb des normalen Bereichs); Grad 2 = leicht (Läsionen können beobachtet werden, sind aber nicht schwerwiegend); Grad 3 = mittel (Die Läsionen sind offensichtlich und wahrscheinlich schwerwiegender) und Grad 4 = schwer (die Läsion hat das gesamte Gewebe und Organ besetzt).

Lektinfärbung

Leberschnitte aus verschiedenen Mäusegruppen wurden geschnitten, entparaffiniert und 30 Minuten lang bei Raumtemperatur mit verdünnten Lektinen gefärbt. Fluorescein-SNA (bindet Sialinsäure, FL-1301-2, 1:200) und Fluorescein-PHA-L (bindet komplexe Glykane, #FL-1111-2, 1:200) wurden von Vector Laboratories erworben. Die Objektträger wurden dann mit DAPI gefärbt und zweimal in PBST (phosphatgepufferte Kochsalzlösung mit Triton X-100) gewaschen und mittels Fluoreszenzmikroskopie (Nikon) abgebildet.

Statistik und Reproduzierbarkeit

Zur Vorbestimmung der Stichprobengröße wurde keine statistische Methode verwendet. Es wurden keine Daten von den Analysen ausgeschlossen. Die Daten werden als Mittelwert ± Standardabweichung (S.D.) dargestellt. Statistische Analysen wurden mit der GraphPad Prism 9-Software (Version 9.0.0) durchgeführt. p < 0,05 wurde als statistisch signifikant angesehen. *p < 0,05; **p < 0,01; ***p < 0,001; ****p < 0,0001; ns, nicht signifikant. In den Legenden wurden biologische Replikate und die Anzahl unabhängiger Experimente angegeben. Alle Experimente, die als repräsentative mikroskopische Aufnahmen oder Gele präsentiert wurden, wurden mindestens dreimal mit ähnlichen Ergebnissen wiederholt.

Zusammenfassung der Berichterstattung

Weitere Informationen zum Forschungsdesign finden Sie in der mit diesem Artikel verlinkten Nature Portfolio Reporting Summary.

Datenverfügbarkeit

Die in dieser Studie generierten DNA-Sequenzierungsdaten wurden in der Gene Expression Omnibus (GEO)-Datenbank unter dem Zugangscode GSE226447 (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/query/acc.cgi?acc=GSE226447) hinterlegt. . ZINC (https://zinc20.docking.org/) und Drugbank (https://go.drugbank.com/) sind öffentlich verfügbare Datensätze. Die Daten, die die Ergebnisse dieser Studie stützen, sind im Artikel und in der Datei mit ergänzenden Informationen verfügbar. Quelldaten werden in diesem Dokument bereitgestellt. Quelldaten werden mit diesem Dokument bereitgestellt.

Quelle

Entdeckung einer versteckten Kammer in der unterirdischen hellenistischen Nekropole von Neapolis durch Muographie

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Die Wissenschaftler berichten in diesem Artikel über die Muographie einer archäologischen Stätte im dicht besiedelten Viertel „Sanità“ im Zentrum von Neapel, zehn Meter unter dem aktuellen Straßenniveau. Mehrere Detektoren, die Myonen – hochenergetische geladene Teilchen, die durch kosmische Strahlung in den oberen Schichten der Atmosphäre erzeugt werden – erkennen können, wurden unterirdisch in einer Tiefe von 18 m installiert, um den Myonenfluß über mehrere Wochen zu messen. Durch die Messung des Differenzflusses mit den aufgestellten Detektoren in einem weiten Winkelbereich haben sie ein Durchstrahlungsbild der oberen Schichten erstellt. Trotz der architektonischen Komplexität des Geländes haben die Forscher die bekannten Strukturen sowie einige unbekannte gut beobachtet. Eine der beobachteten neuen Strukturen ist mit der Existenz einer verborgenen, derzeit nicht zugänglichen Grabkammer vereinbar.

Satellite imagery: Google ©2022 Imagery date 7/29/2020

Überreste der antiken Neapolis mit ihren Gebäuden, Straßen, Aquädukten und Nekropolen, die von den Griechen ab der zweiten Hälfte des ersten Jahrtausends v. Chr. errichtet wurden, sind etwa zehn Meter unter dem heutigen Straßenniveau der Stadt Neapel begraben. Ein kleiner Teil dieses archäologischen Schatzes ist zugänglich, dank der unterirdischen Strukturen wie Wasserzisternen, die seit dem 16. Jahrhundert gebaut wurden, oder Luftschutzbunker, die während des Zweiten Weltkriegs gebaut wurden und versehentlich alte Kulturschichten durchqueren.
Systematische archäologische Ausgrabungen sind in Neapel nicht immer möglich, hauptsächlich wegen Sicherheitsbedenken für Gebäude und Straßen in den dicht besiedelten Stadtteilen. Die Ipogei dei Togati und die Ipogei dei Melograni, in Abb. 1 als Kammern 1 bzw. 4 bezeichnet, sind zwei bekannte griechische Grabkammern, die unterhalb des Sanità-Viertels von Neapel gefunden wurden. Die Gräber sind Teil der antiken Nekropole, die in diesem Gebiet im 6.–3. Jahrhundert v. Chr. angelegt wurde. Wunderschöne Fresken und Altreliefs wurden in diesen antiken Denkmälern gefunden, die von wohlhabenden hellenistischen Familien geschaffen wurden, wie in Abb. 2 gezeigt.

In diesem Gebiet, das später von einer dicken alluvialen Schicht bedeckt wurde, die alle Erinnerungen an die antike Präexistenz verbarg, war eine schnell wachsende Urbanisierung Entwicklung seit dem 16. Jahrhundert. Die neuen Konstruktionen, während sie die alten Denkmäler durchschneiden, haben sie oft eingebaut oder teilweise zerstört. Trotz der tiefgreifenden Veränderungen dieses Gebiets im Laufe der Zeit haben neuere Studien ermöglicht, die ursprüngliche Morphologie der antiken Nekropolenlandschaft mit Grabkammern herauszufinden, die sich entlang der Straße entwickelt hat, die vom Nordtor von Neapolis ausgeht.

Die Untersuchung der integrierten Standorttopologie mit 3D-Vermessungen führte zu der Hypothese eines möglichen Vorhandenseins zusätzlicher Bestattungshypogäen als Teil der hellenistischen Nekropole, wie in Abb. 1 dargestellt. Um diese Hypothese zu untersuchen, haben wir in dieser Arbeit die untersucht Ort mit der Myonen-Radiographie-Technik. Diese moderne Technik besteht aus der Messung des differentiellen Flusses von Myonen, Elementarteilchen, die natürlicherweise in den oberen Schichten der Erdatmosphäre produziert werden.

Das Winkel- und Impulsspektrum von Myonen, ihr Fluss sowie ihre Ausbreitungslänge durch verschiedene Materialien sind gut bekannt. Daher kann dieser ewige Myonenregen auf der Erdoberfläche für die Radiographie, daher die sogenannte Muographie, von massiven Zielen wie Vulkanen 1,2,3,4, unterirdischen Hohlräumen 5,6,7 und ägyptischen Pyramiden 8 verwendet werden. 9. Aufgrund ihrer nicht-invasiven Natur eignet sich diese Technik besonders für städtische Umgebungen, in denen die Anwendung aktiver Inspektionsmethoden wie seismischen Wellen oder Bohrlöchern nicht denkbar ist.

Das Forscherteam hat einen auf der Kernemulsionstechnologie 10 basierenden Detektor verwendet, der die höchste räumliche Auflösung bei der Messung ionisierender Teilchenspuren aufweist. Die Kernemulsion besteht aus winzigen Silberbromidkristallen, die in ein Gelatinebindemittel eingetaucht sind. Die Kristalle wirken als Sensoren, die durch den Ionisationsverlust eines hindurchgehenden geladenen Teilchens aktiviert werden. Der aktivierte Zustand der Kristalle bleibt bis zur chemischen Entwicklung des Emulsionsfilms erhalten. So wird eine Partikelspur aufgezeichnet, zunächst als Abfolge von aktivierten Kristallen, die später nach der Entwicklung zu einer Abfolge von Silberkörnern wird. Die gebildeten Spuren sind an vollautomatischen optischen Mikroskopen sichtbar, wo ihre Position und Richtung gemessen werden.

Emulsionsdetektoren sind einfach, äußerst kompakt und benötigen im Gegensatz zu elektronischen Detektoren keine Stromversorgung 10 oder Gaszuführung. Dadurch eignen sie sich besonders in rauer Umgebung wie in unterirdischen Anlagen oder auf Vulkanen. Es wurden haben zwei Detektormodule verwendet, die in Fig. 3 gezeigt und mit der gleichen Struktur zusammengesetzt wurden, bestehend aus einem Stapel von vier Filmen, 25 × 30 cmbreit und etwa 300 μm dick.

Jeder Emulsionsfilm wurde zur Licht- und Feuchtigkeitsundurchlässigkeit in einer Hülle versiegelt. Die Filmstapel wurden zwischen zwei flache Aluminiumplatten gelegt, die sowohl als Schutzschichten als auch als mechanischer Rahmen des Detektors dienten. Zwischen Deckplatte und Emulsionsfolie wurde eine dünne Weichgummischicht eingebracht, um den Druck gleichmäßig zu verteilen und empfindliche Schichten vor mechanischer Beanspruchung zu schützen.

Die Module wurden im Zeitraum vom 10. März bis 7. April 2018 horizontal für 28 Tage im sogenannten unterirdischen Raum „Chianca“ aufbewahrt, einem Keller, der etwa 18 m unter dem Straßenniveau liegt. Am Ende der Belichtung wurden die Stapel zerlegt und die Filme während des Transports in einer anderen Reihenfolge aufbewahrt. Emulsionsfilme registrieren alle geladenen Teilchen, die die empfindlichen Schichten passieren, bis sie entwickelt werden.
In einer einzelnen Emulsionsplatte können während der Belichtungszeit aufgezeichnete Spuren nicht von den anderswo integrierten Spuren unterschieden werden. Um diese Mehrdeutigkeit zu lösen, verwenden wir normalerweise einen Stapel von zwei oder mehr Emulsionsfilmen, die in einer bestimmten Reihenfolge angeordnet sind, und das Mustervergleichsverfahren, um diese während der Belichtung integrierten Spuren zu identifizieren. Dieses Verfahren zeigt eine Reinheit von mehr als 95 %.

Alle Emulsionen wurden am nächsten Tag nach der Detektorextraktion in Neapel entwickelt.

Normalerweise reichen zwei aufeinanderfolgende Platten für eine eindeutige Rekonstruktion aus. In diesem Experiment wurden Stapel von vier Filmen in zwei Dubletten geteilt. Jede Dublette wurde unabhängig in einem der beiden mit Hochleistungsscansystemen ausgestatteten Scanlabors analysiert: Neapel (Italien) und Nagoya (Japan). Sowohl die Scan- als auch die Analyseketten, die in zwei Labors angewendet wurden, waren unabhängig. Die Endergebnisse sind vollständig kompatibel, was die hohe Qualität beider Verarbeitungen bestätigt.

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Hubble entdeckt eine Galaxie mit Tentakeln

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Image credit: ESA/Hubble & NASA; M. Gullieuszik and the GASP team

Dieses Bild, das mit dem Hubble-Weltraumteleskop der NASA/ESA aufgenommen wurde, zeigt JO204, eine „Quallengalaxie“, die nach den hellen Gasranken benannt ist, die auf diesem Bild erscheinen, während sie träge unter der hellen zentralen Masse von JO204 driftet. Die Galaxie liegt fast 600 Millionen Lichtjahre entfernt im Sternbild Sextant. Hubble beobachtete JO204 im Rahmen einer Durchmusterung, die mit der Absicht durchgeführt wurde, die Sternentstehung unter extremen Bedingungen besser zu verstehen.

Während die zarten Gasbänder unter JO204 wie schwimmende Quallententakel aussehen mögen, sind sie tatsächlich das Ergebnis eines intensiven astronomischen Prozesses, der als Ram Pressure Stripping bekannt ist. Der Staudruck ist eine bestimmte Art von Druck, der auf einen Körper ausgeübt wird, wenn er sich relativ zu einer Flüssigkeit bewegt. Ein intuitives Beispiel ist das Druckgefühl, das Sie empfinden, wenn Sie in einem starken Windstoß stehen – der Wind ist eine sich bewegende Flüssigkeit, und Ihr Körper spürt den Druck davon. Eine Erweiterung dieser Analogie ist, daß Ihr Körper ganz und kohärent bleibt, aber die lockerer gebundenen Dinge – wie Ihre Haare und Ihre Kleidung – im Wind flattern. Dasselbe gilt für Quallengalaxien. Sie erfahren Staudruck aufgrund ihrer Bewegung gegen das intergalaktische Medium, das die Räume zwischen Galaxien in einem Galaxienhaufen füllt. Die Galaxien erfahren durch diese Bewegung einen starken Druck, und als Ergebnis wird ihr lockerer gebundenes Gas abgestreift. Dieses Gas ist meistens das kältere und dichtere Gas in der Galaxie – Gas, das, wenn es durch den Staudruck gerührt und komprimiert wird, zusammenbricht und in den schönen Ranken der Qualle neue Sterne bildet.

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Goldfund enthüllt: Die Dänen glaubten viel früher als gedacht an Odin, Thor und Loki

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Runen auf riesigen Goldschätzen aus Jelling zeigen, daß Odin 150 Jahre früher erwähnt wird als bisher bekannt. Die Entdeckung erschüttert die gesamte nordische Mythologie.

Als die beiden Hobbyarchäologen Jørgen Antonsen und Ole Schytz vor knapp zwei Jahren auf einem Feld bei Jelling einen spektakulären Goldfund machten, haben sie auch unser Wissen über die nordische Mythologie erheblich erweitert. Es stellt sich heraus, daß eines der Goldstücke die weltweit erste Bezeichnung des nordischen Gottes Odin enthält.

Der sogenannte Vindelev-Schatz wurde zuvor als der spektakulärste Runenfund seit den goldenen Hörnern beschrieben. Aber der Name des Gottes fügt einen zusätzlichen Trumpf hinzu:

  • Es ist das erste Mal in der Weltgeschichte, daß Odins Name erwähnt wird, und er führt die nordische Mythologie bis zum Beginn des 4. Jahrhunderts zurück. Das macht den Vindelev-Fund noch spektakulärer, sagt die Schriftforscherin Lisbeth Imer vom Nationalmuseum.

Den Forschern zufolge bedeutet dies, daß die Götter, die wir aus der nordischen Mythologie kennen, bereits zu Beginn des 4. Jahrhunderts bekannt waren, also 150 Jahre früher als bisher nachgewiesen.
Die Entdeckung erfolgte, nachdem die Forscher einige Zeit damit verbracht hatten, die Runen und Schnitzereien auf den 22 rund 800 Gramm schweren Goldobjekten, sogenannten Brakteaten, zu entziffern.

Auf einem der Brakteaten steht der Satz „Er ist Odins Mann“ und bezieht sich auf das Porträt des Brakteaten eines unbekannten Königs oder großen Mannes. Und es ist der Satz, der zeigt, daß der Glaube an die nordischen Götter real war, früher als man bisher geglaubt hat.
Es war jedoch keine leichte Aufgabe, genau zu entschlüsseln, was die Runen tatsächlich bedeuteten.

  • „Die Runeninschrift war in meinen 20 Jahren als Runologin im Nationalmuseum am schwierigsten zu interpretieren, aber die Entdeckung ist auch absolut phantastisch“, erklärt Lisbeth Imer.

Laut den Forschern sind die Entdeckungen wichtig, weil sie dazu beitragen, die dänische Geschichte neu zu schreiben.

„Ich habe seit den goldenen Hörnern nicht mehr so ​​gut ausgeführte Runen und einen so langen Text auf einem dänischen Fund aus dieser Zeit gesehen“, sagt Lisbeth Imer.

  • Es könnte ein Schlüssel zum Verständnis anderer prähistorischer Runeninschriften werden, die wir bisher nicht lesen konnten.

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Kleine Inseln und große biogeografische Barrieren haben bei indopazifischen Nektarvögeln zu gegensätzlichen Artbildungsmustern geführt.

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Männlicher Grünrücken-Nektarvogel (Cinnyris jugularis)

Vögel des Indopazifik haben Biologen viele grundlegende Erkenntnisse geliefert. Diese Studie liefert Beweise für eine starke phylogeographische Struktur bei zwei Nektarvogelarten aus dem Herzen dieser Region, dem Olivenrücken-Nektarvogel Cinnyris jugularis und dem schwarzen Sunbird Leptocoma aspasia. Die Forscher bewerteten die Populationsdivergenz anhand von morphologischen, Gefieder-, bioakustischen und molekularen Daten (mitochondriale ND2/ND3). Ihre Ergebnisse deuten darauf hin, daß der Sonnenvogel mit Olivenrücken als mehrere Arten anerkannt werden sollte, da Vögel aus Sulawesi und dem Sahul-Schelf eng miteinander verwandt, aber weit von denen in anderen Regionen getrennt sind. Darüber hinaus liefert die Studie Beweise für eine endemische Art auf den Wakatobi-Inseln, einem Archipel von Tiefseeinseln vor Südost-Sulawesi. Daß ein kleiner Vogel ein Verbreitungsgebiet von Sulawesi bis Australien aufweisen konnte, während er innerhalb dieses Verbreitungsgebiets auf einem kleinen Archipel auseinanderging, veranschaulicht das komplexe Zusammenspiel zwischen Ausbreitung und Artenbildung. Die genetischen Daten des Schwarzen Sonnenvogels deuten auch auf eine unbekannte Populationsstruktur hin, trotz einer relativ schwachen Gefiederdivergenz. Schwarze Sonnenvögel in Sulawesi sind wahrscheinlich eine andere Art als die in Neuguinea, mit einer durchschnittlichen genetischen Distanz von 9,1%. Die aktuelle Taxonomie legt nahe, daß diese Nektarvogel-Arten klassische biogeografische Barrieren überschreiten, aber die Forschungsergebnisse deuten darauf hin, daß diese Barrieren nicht einfach umgangen werden können.

Wallacea ist eine zentralindonesische Region, die aus Inseln besteht, die durch tiefes Wasser getrennt sind und zwischen den viel flacheren Kontinentalsockeln Sunda und Sahul liegen (Merrill, 1924; Dickerson et al., 1928). Aufgrund von Änderungen des Meeresspiegels während der Vereisung (Voris, 2000) wirkten die Grenzen zwischen diesen kontrastierenden Wassertiefen als Barrieren für die Ausbreitung vieler Organismen, was zu deutlichen Unterschieden bei den Tieren auf beiden Seiten führte (Lohman et al., 2011). . Die Wallacean-Inseln spielten eine wichtige Rolle in der Evolution von Singvögeln und boten Wege für die Ausbreitung und Strahlung, nachdem die Gruppe in Australien entstanden war (Moyle et al., 2016). Die größte Insel von Wallacea, Sulawesi, hat eine komplexe geologische Geschichte, die ihre ausgeprägten Muster des biologischen Endemismus geprägt hat (Michaux & Ung, 2021). Die westliche Grenze zwischen Wallacea und dem Sunda-Schelf ist als Wallace-Linie bekannt (Wallace, 1863; Huxley, 1868), obwohl Wallace Schwierigkeiten hatte, zu entscheiden, wo er seine Linie relativ zu Sulawesi positionieren sollte (Ali & Heaney, 2021) und diese Insel als „anomal“ betrachtete “ (Walace, 1880). Die östliche Grenze zwischen Wallacea und dem Sahul-Schelf wurde erstmals von Heilprin (1887) als biogeografische Barriere beschrieben, ist heute aber am besten als Lydekker-Linie bekannt (Lydekker, 1896; Ali & Heaney, 2021). Als Übergangszone zwischen auffallend unterschiedlichen Biotas (Merrill, 1924; Dickerson et al., 1928) hat Wallacea das Gebiet der Biogeographie mit vielen grundlegenden Erkenntnissen ausgestattet (Wallace, 1860, 1863), und die Arbeit in der Region verbessert unsere weiterhin Verständnis der Evolutionstheorie im Allgemeinen sowie der Evolutionsgeschichte vieler verschiedener Organismen (Moyle et al., 2016; Rowe et al., 2019; Hardianto et al., 2021; Purnomo et al., 2021).

Wallacea gilt als Hotspot bedrohter Biodiversität (Myers et al., 2000). Die Bedeutung der Wallacean-Biodiversität wird immer deutlicher: Die neueste Ausgabe des aktuellen Nachschlagewerks zu den Vögeln der Region (Eaton et al., 2021) erkennt 27 zusätzliche endemische Arten im Vergleich zur ersten Ausgabe an, die etwas mehr als vier Jahre zuvor veröffentlicht wurde . Eatonet al. (2021) sortierten ihre taxonomischen Empfehlungen in zwei Kategorien: Splits und „Limbo-Splits“, die „mögliche Splits sind, die entweder in der Literatur erwähnt wurden, aber der Meinung der Wissenschaftler nach schwach oder unzureichend sind, oder sie wurden im Allgemeinen nicht in der früheren Literatur erwähnt, und die Forscher sind der Meinung, daß das Potenzial für eine Aufspaltung beträchtlich ist“ (Rheindt, 2021). Die überwiegende Mehrheit der neuen Wallacean-Taxa, einschließlich Splits und außergeöhnlichen Splits , ist auf bestimmte Inseln beschränkt (Eaton et al., 2021) und daher streng allopatrisch. Die konsistente Abgrenzung allopatrischer Taxa bleibt herausfordernd, selbst wenn Daten verfügbar sind (Tobias et al., 2021). Daher sind noch spezifische und detaillierte Untersuchungen erforderlich, um die Vielfalt der Vögel auf den vielen Inseln von Wallacea zu klären. Eine Lösung für das Problem der Allopatrie (z. B. Cheke et al., 2001; Mayr & Diamond, 2001) besteht darin, sich mit „Superspezies“ zu befassen, definiert als monophyletische Gruppen allopatrischer Populationen, von denen angenommen wird, dass sie reproduktiv isoliert sind, basierend auf einem Vergleich mit sympatrischen Arten (Amadon, 1966).

Die Inseln von Wallacea sind unterschiedlich in Größe und Isolationsgrad, was diese Region zu einem idealen „natürlichen Labor“ (Whittaker et al., 2017) für die Untersuchung biogeografischer Fragestellungen macht (z. B. Ó Marcaigh et al., 2021a, b, 2022) . Beispielsweise gibt es in der Region Südost-Sulawesi kontinentale Landbrückeninseln wie Wawonii (oder Wowoni), Kabaena, Muna und Buton (oder Butung), die auf dem Landweg mit dem viel größeren Sulawesi und geologisch miteinander verbunden waren jüngsten Vergletscherungen (Hall, 2013). Andererseits sind die kleineren Wakatobi-Inseln (auch als Tukangbesi-Inseln bekannt) seit ihrer Entstehung keiner größeren Landmasse zugeordnet worden (Nugraha & Hall, 2018). Die Wakatobi-Inseln sind als wichtiges Vogelgebiet anerkannt (BirdLife International, 2021), aber trotz ihrer Bedeutung erhielten sie bis vor kurzem wenig ornithologische Aufmerksamkeit (O’Connell et al., 2020). Obwohl die Wakatobi-Inseln nur 27 km von Buton entfernt sind, beherbergen sie mehrere endemische Arten (Kelly et al., 2014; O’Connell et al., 2019c), ein Beweis für eine bedeutende evolutionäre Unabhängigkeit von Sulawesi und seinen Landbrückeninseln. Eine weitere kleine Insel, Menui (oder Manui), liegt nördlich von Wawonii. Der Kanal zwischen Menui und Sulawesi ist geologisch besonders komplex, scheint aber während der pleistozänen Vergletscherung keine Landbrücke gebildet zu haben (Nugraha & Hall, 2018).

Die Nektarvögel (Nectariniidae) sind eine Familie kleiner Sperlingsvögel mit einer Verbreitung, die sich von Afrika im Westen bis nach Australien im Osten erstreckt. In einer Region, in der Vögel die Grundlage für viele entscheidende evolutionäre Arbeiten lieferten, haben Nektarvögel oft besondere Aufmerksamkeit auf sich gezogen (z. B. Jardine, 1843; Wallace, 1855; Shelley, 1876–1880). Viele weisen ein auffallend buntes Gefieder auf, das Taxonomen über ihre Vielfalt informiert hat (Cheke et al., 2001). Tatsächlich leiten die Nektarvögel als Gruppe „ihren Namen von ihrer hell getönten Kleidung ab, die in größerer Pracht erscheint, wenn sie von den Sonnenstrahlen bespielt wird (Sonnenvögel)“ (Jardine, 1843). In Bezug auf ihre Evolution bleibt noch viel zu klären, da Arten weiterhin auf der Grundlage neuer Informationsquellen wie Genetik und Bioakustik unterteilt werden (Rheindt, 2021). Unser Verständnis von Biodiversität entwickelt sich weiter, während wir weiterhin Abstammungslinien auf Artenebene dokumentieren und identifizieren (Fišer et al., 2018).

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Jupiter erreicht in Kürze durch die Opposition seine engste Annäherung an die Erde seit 70 Jahren

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Sterngucker können die ganze Nacht vom Montag, den 26. September, wenn der Riesenplanet die Opposition erreicht, eine hervorragende Sicht auf Jupiter erwarten. Aus Sicht der Erdoberfläche entsteht Opposition, wenn ein astronomisches Objekt im Osten aufgeht, während die Sonne im Westen untergeht, wodurch das Objekt und die Sonne auf gegenüberliegenden Seiten der Erde platziert werden.

Jupiters Opposition tritt alle 13 Monate auf und lässt den Planeten größer und heller erscheinen als zu jeder anderen Jahreszeit. Aber das ist nicht alles. Jupiter wird sich der Erde nähern wie seiz 70 Jahren nicht mehr.

Dies geschieht, weil Erde und Jupiter die Sonne nicht in perfekten Kreisen umkreisen – was bedeutet, daß die Planeten das ganze Jahr über in unterschiedlichen Abständen aneinander vorbeiziehen. Jupiters größte Annäherung an die Erde fällt selten mit Opposition zusammen, was bedeutet, daß die diesjährigen Aussichten außergewöhnlich sein werden. Bei seiner größten Annäherung wird Jupiter ungefähr 365 Millionen Meilen von der Erde entfernt sein. Der massereiche Planet ist an seinem weitesten Punkt etwa 600 Millionen Meilen von der Erde entfernt.

Credits: NASA, ESA, A. Simon (Goddard Space Flight Center), and M.H. Wong (University of California, Berkeley)

„Die Aussicht sollte für ein paar Tage vor und nach dem 26. September großartig sein“, sagte Kobelski. „Nutzen Sie also das gute Wetter innerhalb des Zeitfensters, um den Anblick zu genießen. Außerhalb des Mondes sollte es eines der (wenn nicht das) hellsten Objekte am Nachthimmel sein.“

Jupiter hat 53 benannte Monde, aber Wissenschaftler glauben, daß insgesamt 79 Monde entdeckt wurden. Die vier größten Monde, Io, Europa, Ganymed und Callisto, werden die Galileischen Monde genannt. Sie sind nach dem Mann benannt, der sie 1610 zum ersten Mal beobachtete, Galileo Galilei. In einem Fernglas oder einem Teleskop sollten die galiläischen Satelliten während der Opposition als helle Punkte auf beiden Seiten des Jupiter erscheinen.

Die NASA-Raumsonde Juno, die Jupiter seit sechs Jahren umkreist, ist der Erforschung der Oberfläche des Planeten und seiner Monde gewidmet. Juno begann seine Reise im Jahr 2011 und erreichte Jupiter fünf Jahre später. Seit 2016 liefert die Raumsonde unglaubliche Bilder und Daten über Jupiters lebhafte Atmosphäre, innere Strukturen, inneres Magnetfeld und Magnetosphäre.

Wissenschaftler glauben, daß die Untersuchung von Jupiter zu bahnbrechenden Entdeckungen über die Entstehung des Sonnensystems führen kann. Die Mission von Juno wurde kürzlich bis 2025 beziehungsweise bis zum Ende der Lebensdauer des Raumfahrzeugs verlängert. Erfahren Sie mehr über Juno.

Das nächste große Projekt für die Jupiter-Exploration ist der Europa Clipper. Dieses Raumschiff wird Jupiters ikonischen Mond Europa erkunden, der für seine eisige Hülle bekannt ist. NASA-Wissenschaftler gehen davon aus, daß unter der Oberfläche ein riesiger Ozean liegt, und wollen feststellen, ob in Europa lebensfähige Bedingungen herrschen. Der geplante Start von Europa Clipper ist derzeit für Oktober 2024 geplant.

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Glioblastom bei Mäusen in bahnbrechender israelischer Studie ausgerottet

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Eine bahnbrechende Studie an der Universität Tel Aviv (TAU) hat Glioblastoma multiforme (GBM) – eine hochtödliche Art von Hirntumoren – in Versuchen mit Mäusen im Labor effektiv eliminiert. Die Forscher erzielten das Ergebnis mit einer Methode, die sie auf der Grundlage ihrer Entdeckung zweier entscheidender Mechanismen im Gehirn entwickelt haben, die das Wachstum und Überleben von Tumoren unterstützen: Einer schützt Krebszellen vor dem Immunsystem, während der andere die Energie liefert, die für ein schnelles Tumorwachstum erforderlich ist.

Das Team fand heraus, daß beide Mechanismen von Gehirnzellen gesteuert werden, die Astrozyten genannt werden, die Nervenzellen unterstützen, und wenn sie fehlen, sterben die Tumorzellen und werden eliminiert.

„Diese Ergebnisse bieten eine vielversprechende Grundlage für die Entwicklung wirksamer Medikamente gegen GBM, einen aggressiven und bisher unheilbaren Krebs, sowie andere Arten von Hirntumoren“, so die Forscher.

Ein Glioblastom kann im Gehirn oder Rückenmark auftreten und sich in jedem Alter entwickeln, obwohl es dazu neigt, sich bei älteren Erwachsenen zu entwickeln. Seine Ursachen sind weitgehend unbekannt, aber der Krebs tritt häufig bei Menschen mit seltenen genetischen Erkrankungen wie Turcot-Syndrom, Neurofibromatose Typ 1 und Li-Fraumeni-Syndrom auf, aufgrund von Mutationen in einem bestimmten Gen, das viele der charakteristischen Merkmale des Glioblastoms verursacht.

Erste Symptome sind Kopfschmerzen, die sich verschlimmern, Übelkeit, Erbrechen und Krampfanfälle. Diese treten in der Regel am frühen Morgen auf und werden oft anhaltend oder schwerwiegend; Die Art der Anfälle hängt davon ab, wo sich der Tumor im Gehirn befindet. Nur einer von 10 Opfern dieses Krebses überlebt fünf Jahre.

Er macht 48 % aller primären bösartigen Hirntumore aus, wobei allein in den USA in einem durchschnittlichen Jahr mehr als 10.000 Menschen daran sterben.


Bei GBM „sind die Tumorzellen sehr resistent gegen alle bekannten Therapien“, sagten die Forscher und fügten hinzu, „leider hat sich die Lebenserwartung der Patienten in den letzten 50 Jahren nicht signifikant erhöht.“


Wie haben sie die Studie durchgeführt?
Die Studie wurde von der Doktorandin Rita Perelroizen unter der Leitung von Dr. Lior Mayo von der Shmunis School of Biomedicine and Cancer Research und der Sagol School of Neuroscience in Zusammenarbeit mit Prof. Eytan Ruppin von den US National Institutes of Health (NIH) geleitet.

Das Paper, das in der renommierten Fachzeitschrift Brain unter dem Titel „Astrocyte immunometabolic Regulation of the Tumor Microenvironment Drives Glioblastoma Pathogenicity“ veröffentlicht wurde, wurde mit einem speziellen Kommentar hervorgehoben.

Die Forscher gingen die Herausforderungen von GBM aus einem neuen Blickwinkel an. Anstatt sich auf den Tumor zu konzentrieren, zielten sie auf seine unterstützende Mikroumgebung – das Gewebe, das die Tumorzellen umgibt. „Speziell haben wir Astrozyten untersucht – eine Hauptklasse von Gehirnzellen, die eine normale Gehirnfunktion unterstützen, die vor etwa 200 Jahren entdeckt und nach ihrer sternförmigen Form benannt wurde“, erklärte Mayo.

„In den letzten zehn Jahren haben Forschungen von uns und anderen zusätzliche Astrozytenfunktionen offenbart, die verschiedene Gehirnerkrankungen entweder lindern oder verschlimmern. Unter dem Mikroskop stellten wir fest, dass aktivierte Astrozyten GBM-Tumoren umgaben. Basierend auf dieser Beobachtung machten wir uns daran, die Rolle von Astrozyten beim Glioblastom-Tumorwachstum zu untersuchen.“

Unter Verwendung von Mäusen, bei denen sie aktive Astrozyten um den Tumor herum eliminieren konnten, fanden die Forscher heraus, dass der Krebs in diesen sternförmigen Gehirnzellen alle Tiere mit Glioblastom-Tumoren innerhalb von vier oder fünf Wochen tötete. Bei der Anwendung einer einzigartigen Methode zur gezielten Beseitigung der Astrozyten in der Nähe des Tumors beobachteten sie ein dramatisches Ergebnis – der Krebs verschwand innerhalb weniger Tage und alle behandelten Tiere überlebten. Darüber hinaus überlebten die meisten Tiere auch nach Absetzen der Behandlung.

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Quelle 2

Archäologen führen erste Ausgrabungen an Grab mit Bezug auf König Artus durch

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Archäologen der University of Manchester haben mit Ausgrabungen an einem 5.000 Jahre alten Grab begonnen, das mit König Artus in Verbindung steht, in der Hoffnung, dabei einige der Geheimnisse rund um die rätselhafte Stätte zu lösen.

Die Experten arbeiten in Partnerschaft mit English Heritage, das sich um Arthur’s Stone in Herefordshire kümmert, um Rasen zu entfernen, um besonders sensible archäologische Überreste freizulegen und aufzuzeichnen.

Arthur’s Stone ist ein neolithisches Kammergrab, das noch nie zuvor ausgegraben wurde, aber English Heritage sagt, daß ähnliche Beispiele in derselben Region gefunden wurden, die unvollständige Skelettreste mehrerer Menschen zusammen mit Feuersteinflocken, Pfeilspitzen und Keramik enthielten.

Heute sind nur noch die großen Steine ​​der inneren Kammer übrig, die in einen Erd- und Steinhaufen gelegt wurden, dessen ursprüngliche Größe und Form ein Rätsel bleibt. Die Kammer besteht aus neun aufrechten Steinen, auf deren Spitze sich ein riesiger Deckstein befindet, der schätzungsweise mehr als 25 Tonnen wiegt.

Wie viele prähistorische Denkmäler in Westengland und Wales ist dieses Grab schon vor dem 13. Jahrhundert mit König Artus in Verbindung gebracht worden. Der Legende nach erschlug Artus hier einen Riesen, der beim Fallen den Abdruck seiner Ellbogen auf einem der Steine ​​hinterließ.

In jüngerer Zeit soll sich der Autor CS Lewis von der Gegend inspirieren lassen, als er seine fiktive Welt von Narnia erschuf – mit Artusstein als Inspiration für den Steintisch, auf dem Aslan der Löwe in „Der Löwe, die Hexe und die Garderobe“ geopfert wird .

„Arthur’s Stone ist eines der bedeutendsten steinzeitlichen Denkmäler des Landes, und diese Ausgrabung bietet der Öffentlichkeit eine wirklich seltene und aufregende Gelegenheit, Archäologie in Aktion zu sehen“, sagte Ginny Slade, Volunteer Manager bei English Heritage. „Unser Team aus wunderbaren Freiwilligen wird vor Ort sein, um die neuesten Ergebnisse zu erklären, sobald sie geschehen. Wir bitten die Leute, im Voraus zu buchen, um sicherzustellen, daß jeder die Chance hat, diese großartige Gelegenheit zu nutzen.“

Die Ausgrabung folgt Forschungen, die im vergangenen Jahr von den Universitäten Manchester und Cardiff unmittelbar südlich des Denkmals durchgeführt wurden und die bereits die Sichtweise über die Ausrichtung und den Ursprung der Stätte verändert haben.

Es wurde angenommen, daß Arthur’s Stone in einem keilförmigen Steinhaufen stand, ähnlich denen, die in den Cotswolds und Südwales gefunden wurden, aber Professor Julian Thomas aus Manchester und Professor Keith Ray aus Cardiff fanden heraus, daß sich das Denkmal ursprünglich in ein Feld im Südwesten erstreckte kann die Form eines niedrigen Rasenhügels mit abgerundeten Enden angenommen haben. Die Professoren Thomas und Professor Ray werden auch die bevorstehenden Ausgrabungen leiten, an denen Studenten der Cardiff University und einer Reihe amerikanischer Institutionen teilnehmen werden.

University of Manchester

Hubble untersucht einen rätselhaften Sternhaufen

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Image credit: ESA/Hubble & NASA, A. Dotter

Wie die Lupe des Sherlock Holmes kann das NASA/ESA-Weltraumteleskop Hubble auf der Suche nach Hinweisen in ein astronomisches Mysterium blicken.

Das fragliche Rätsel betrifft den hier abgebildeten Kugelsternhaufen Ruprecht 106. Im Gegensatz zu den meisten Kugelsternhaufen könnte Ruprecht 106 das sein, was Astronomen einen Kugelsternhaufen mit einer einzigen Population nennen. Während die meisten Sterne in einem Kugelsternhaufen ungefähr am selben Ort und zur gleichen Zeit entstanden, stellt sich heraus, daß fast alle Kugelsternhaufen mindestens zwei Gruppen von Sternen mit unterschiedlichen chemischen Zusammensetzungen enthalten.

Die neueren Sterne werden eine andere chemische Zusammensetzung haben, die Elemente enthält, die von ihren älteren, massiven Haufenbegleitern verarbeitet wurden. Eine winzige Handvoll Kugelsternhaufen besitzt diese multiplen Populationen von Sternen nicht, und Ruprecht 106 ist ein Mitglied dieser rätselhaften Gruppe.

Hubble nahm dieses mit Sternen übersäte Bild mit einem seiner vielseitigsten Instrumente auf, der Advanced Camera for Surveys (ACS). Ähnlich wie die Sterne in Kugelsternhaufen repräsentieren auch die Instrumente von Hubble unterschiedliche Generationen: ACS ist ein Instrument der dritten Generation, das 2002 die ursprüngliche Faint Object Camera ersetzte.

Einige andere Instrumente von Hubble haben ebenfalls drei Iterationen durchlaufen: Die Wide Field Camera 3 ersetzte die Wide Field and Planetary Camera 2 (WFPC2) während der letzten Wartungsmission zu Hubble. WFPC2 selbst ersetzte die ursprüngliche Wide Field and Planetary Camera, die vor ihrem Start auf Hubble installiert war.

Astronauten des Space Shuttles haben Hubble insgesamt fünf Mal im Orbit gewartet und konnten entweder veraltete Geräte aufrüsten oder Instrumente durch neuere, leistungsfähigere Versionen ersetzen. Diese High-Tech-Tüftelei im erdnahen Orbit hat dazu beigetragen, Hubble seit mehr als drei Jahrzehnten an der Spitze der Astronomie zu halten.

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Salurn – Dos de la Forca (Etschtal, Norditalien): Eine einzigartige Feuerbestattungsstätte der späten Bronzezeit

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Die archäologische Stätte von Salurn – Dos de la Forca (Bozen, Südtirol) bietet eine der seltensten und bedeutendsten Dokumentationen eingeäscherter menschlicher Überreste, die von einer antiken Einäscherungsplattform (Ustrinum) erhalten worden sind. Das Scheiterhaufengebiet entlang des oberen Etschtals wird in die Spätbronzezeit (ca. 1.150–950 v. Chr.) datiert und hat eine beispiellose Menge eingeäscherter menschlicher Überreste (ca. 63,5 kg) sowie verbrannte Tierknochenfragmente und Scherben hervorgebracht, darunter Keramik und andere Grabbeigaben aus Bronze und Tierknochen/Geweih.

Diese Studie konzentriert sich auf die bioanthropologische Analyse der menschlichen Überreste und diskutiert die Entstehung der ungewöhnlichen Brandablagerungen auf Salurn durch Vergleiche mit modernen Praktiken und protohistorischen und zeitgenössischen archäologischen Ablagerungen.


Das Muster der Knochenfragmentierung und -vermischung wurde anhand von während der Ausgrabung aufgezeichneten räumlichen Daten untersucht, die zusammen mit den bioanthropologischen und archäologischen Daten verwendet werden, um zwei Hypothesen zu modellieren und zu testen: Salorno – Dos de la Forca wäre das Ergebnis von A) wiederholten primären Einäscherungen vor Ort belassen; oder B) von Restmaterial, das zurückbleibt, nachdem ausgewählte Elemente für die Internierung in Urnen oder Bestattungen an unbekannten Deponieorten entfernt wurden. Durch die Modellierung von Knochengewicht und demografischen Daten, die aus regionalen affinen Kontexten stammen, schlagen die Autoren vor, daß diese Einäscherungsstätte möglicherweise über mehrere Generationen von einer kleinen Gemeinschaft – vielleicht einer lokalen Elite – genutzt wurde.
Mit einer Menge an menschlichen Überresten, die die aller anderen zeitgenössischen Kontexte übersteigt, die als ustrina interpretiert werden, könnte Salurn das Produkt einer komplexen Reihe von Ritualen sein, bei denen die menschlichen Überreste nicht individuell begraben wurden, sondern in situ, in einem kollektiven / kommunalen Ort der Primärverbrennung, der einen Bereich wiederholter Bestattungszeremonien mit Opfergaben und Trankopfern über mehrere Generationen definiert. Dies würde eine neue typologische und funktionale Kategorie darstellen, die zur Variabilität der Bestattungsbräuche am Ende der Bronzezeit im Alpenraum hinzukommt, zu einer Zeit, in der „globalisierende“ soziale Trends die Definition privaterer Identitäten angeregt haben könnten.

Ab dem 2. Jahrtausend v. Chr. Bis in die Römerzeit werden Menscheneinäscherungen auf der gesamten italienischen Halbinsel, im Alpenraum und in Mitteleuropa ausgiebig praktiziert. Die archäologische Dokumentation von Scheiterhaufen (oder Ustrina) ist jedoch spärlich und lückenhaft [z. 1–7]. Ein solcher Mangel an Beweisen ist nicht überraschend, wenn wir bedenken, daß alte Einäscherungen im Freien durchgeführt wurden, mittels Scheiterhaufen, die selten mit permanenten oder semi-permanenten Strukturen ausgestattet waren. Wie durch eine Reihe experimenteller archäologischer Studien bestätigt wurde, sind Scheiterhaufen äußerst kurzlebiger Natur [1, 8–13]. Sofern nicht mit permanenten oder semi-permanenten Strukturen gebaut, ist es für Scheiterhaufenreste schwierig, auf dem Boden zu bleiben. Asche und kleine Holzkohlestücke könnten in situ zurückgelassen und durch atmosphärische Mittel leicht dispergiert werden. Aufgrund dieser Vergänglichkeit im Einäscherungsprozess haben wir nur ein teilweises Verständnis der Rituale, die mit der Einäscherung der Toten verbunden sind – mehr um die Behandlung der Knochen nach der Einäscherung (das sogenannte Ossilegie) als um die Vorbehandlung (Vorbereitung des Leichnams) und zentralen (Einäscherung) Phasen der Trauerfeier.

Die Mehrheit der spätbronzezeitlichen Einäscherungen aus Mitteleuropa wird allgemein als „Urnenfeldtradition“ bezeichnet und ist durch die Verwendung von Urnen zur Aufbewahrung menschlicher Beigaben zusammen mit anderen verbrannten Gegenständen und Opfergaben gekennzeichnet, die normalerweise auf Friedhöfen aufgestellt werden [14–16]. Seltener werden Knochenreste ohne Behälter im Boden vergraben.

Diese Studie präsentiert und diskutiert die Funde einer einzigartigen Fallstudie im Oberen Etschtal (Italien), die durch ungewöhnliche Brandablagerungen mit einer außergewöhnlichen Menge an menschlichen Überresten und dazugehörigen archäologischen Überresten gekennzeichnet ist. Insbesondere untersuchen die Autoren zwei Hypothesen, um zu verstehen, ob Salurn – Dos de la Forca (abgekürzt Salurn) interpretiert werden kann als A) das Ergebnis wiederholter primärer Einäscherungen, die an Ort und Stelle belassen wurden, oder B) das Ergebnis von Restmaterialien, die nach ausgewählten Elementen zurückblieben zur Beisetzung in Urnen oder Bestattungen an unbekannten Bestattungsorten entfernt.

Dank einer besonders sorgfältigen Dokumentationsarbeit bei den Ausgrabungen und einer genauen Analyse von Größe, Gewicht und räumlicher Verteilung der Cremains bietet die Fundstelle Salurn neue Einblicke in die Variabilität der Bestattungsrituale in Mitteleuropa während der Bronzezeit.

Die Fülle eingeäscherter menschlicher Überreste in Urnen und Gruben aus der mittleren Bronzezeit (1450 v. Chr.) Bis zur frühen Eisenzeit bestätigen, daß dieses Ritual in dieser Zeit bei weitem die beliebteste Praxis in Europa war. Leider sind die zeitgenössischen archäologischen Aufzeichnungen weniger großzügig mit Hinweisen auf Orte, an denen alte Einäscherungen (ustrina) stattfanden – was zu einem Mangel an Informationen über die verschiedenen Phasen des Rituals führt.

Das Einäscherungsritual muss per se ein spektakuläres Ereignis gewesen sein – wobei die Verwendung von Feuer komplexe und teure Vorgänge implizierte, die von der Vorbereitung der Leiche und des Scheiterhaufens selbst reichten; zur Urne und Grabbeigaben; zum Sortieren, Sammeln, Waschen und Verwahren der Knochen in der Urne (Ossilegie); zu Trankopfern zu Ehren des Verstorbenen während und nach dem Scheiterhaufen; bis zur endgültigen Beisetzung in der Nekropole [17, 18].

Jede dieser Operationen muss einen symbolischen/religiösen Wert gehabt haben, der durch die Kontinuität dieses Rituals über viele Jahrhunderte im späten 2. und 1. Jahrtausend v. Chr. in Norditalien bestätigt wurde.


Tatsächlich wurde der Übergang von der Körperbestattung zum weit verbreiteten Feuerbestattungsritual in verschiedenen europäischen Regionen während der mittleren und späteren Phase der Bronzezeit als ein Moment der Verschiebung in der Phänomenologie oder Ästhetik des Todes, der Erinnerung an die Ahnen, und der Beziehung zu Welt und Materie [15, 16, 19–21] – möglicherweise auf Seiten ökologischer, sozialer, politischer, aber auch gesundheitlicher Gründe [22].

Die weite Verbreitung des Feuerbestattungsrituals in dieser Zeit, das in der Vergangenheit eine monolithisch definierte Urnenfelderkultur [15] war, begann diskontinuierlich und nahm aufgrund von Synkretismen mit lokalen Traditionen allmählich regionalere Konnotationen an. Die Verbreitung des „Urnenfeldmodells“ mit Hunderten oder Tausenden von nebeneinander angeordneten Bestattungen breitete sich nicht linear in ganz Europa aus. Vom Ursprungsort in der Donauebene (im Kontext der Vatya-Erzählungen zwischen Donau und Theiß um 2.000 v. Chr.) breitete sie sich entlang bevorzugter Linien und Netzkorridore aus.

Ab der mittleren Bronzezeit 2/3 (Bronzezeit B2/C1; 1.500–1.450 v. Chr.) beobachten wir eine frühzeitige und massive Übernahme des „Urnenfeldes“ bei den Tieflandterramare in der Poebene und Gruppen aus den offenen Feldern der Balkanregionen – zwischen Donau, Save und Drau (z. B. im Kontext der Belegis 1- oder Virovitica-Kultur [16, 23, 24]. Umgekehrt scheinen die Alpen, Istrien und der Karst bei der Übernahme dieses Rituals zu verweilen. Ab der Spätbronzezeit treten Urneneinäscherungen auch in den Alpentälern auf, häufiger in kleinen Bestattungsgruppen.

Aufgrund dieser Variabilität des „Urnenfeldmodells“ auf regionaler Ebene ist die Platzierung von Salurn nicht einfach, da es sich jenseits der Grenze zwischen den Kulturen des Alpen- und Po-Tieflandes befindet.

Der Fundort Salurn – Dos de la Forca liegt am linken Einzugsgebiet der Etsch – etwa 30 Kilometer südlich von Bozen (Südtirol) [25] (Abb. 1). Die Lokalität wurde gründlich untersucht und liefert archäologische Beweise ab dem frühen Holozän [26]. Eine systematischere Besetzung des Gebiets findet jedoch in der späten Vorgeschichte sowie in der Frühgeschichte und Römerzeit statt. Der mikroökologische Kontext des Standorts ist der einer Hangablagerung am Fuße von – hier praktisch senkrechten – Felswänden, die die Westflanke des Monte Alto (Geiersberg, 1.083 m ü.d.M.) am östlichsten Rand der Etschschwemmebene bilden (S1 Abb.).

Diese Anhäufungen wurden aufgrund der hervorragenden Qualität des Schutts, aus dem sie bestehen, intensiv für die Gewinnung von Kies und Bauzuschlagstoffen kultiviert [25]. In der Spätbronzezeit lag Salurn auf einer natürlichen Engstelle im Etschtal – weder für Landwirtschaft noch Besiedlung geeignet. Dies könnte die Wahl des Ortes für Bestattungsrituale erklären, obwohl andere symbolische/ideologische Gründe im Zusammenhang mit der Nähe des Ortes zu Wasser nicht auszuschließen sind.

Die Fundstelle wurde 1986 im Zusammenhang mit einer Kiesgrube (Cava Girardi) entdeckt. Im folgenden Jahr führte die Landeshauptmannschaft für Kulturgüter Bozen archäologische Untersuchungen in einem teilweise von Baggern betroffenen Gebiet durch [27]. Eine stratigraphische Ausgrabung enthüllte ein subkreisförmiges Merkmal (mit dem Namen „US 11“) von etwa 6 m Durchmesser (Abb. 2), das durch eine stark kohlenstoffhaltige erdige Verbindung gekennzeichnet ist – sehr reich an Keramikresten, winzigen verbrannten Knochenfragmenten, Glaspastenperlen, und Bronze- und Geweihgegenstände (S2 Abb.) − die sofort auf eine alte Aktivität als Scheiterhaufen und damit verbundenes Gebiet der Totenverehrung hindeuteten.

Innerhalb von US 11 wurden zwei bis zu 20 cm tiefe Konzentrationen von Keramikfragmenten freigelegt (Merkmale US 14 und US 18), die mehrere Dutzend zerbrochener Gefäße mit scharfen Kanten in fast direktem Kontakt miteinander lieferten, als ob sie minutiös fragmentiert wären wiederholt zertrampelt (S3 Abb.). Im Gegensatz zum Rest von US 11 wurden unter den Tonscherben keine verbrannten Knochen gefunden, was darauf hindeutet, daßs die Einäscherungsplattform spezielle Zonen für verschiedene rituelle Aktivitäten hatte. Der südwestliche Rand des Gebiets wurde von einem großen, quadratischen Felsblock begrenzt, der in seiner Länge von einem breiten und tiefen Riss durchschnitten wurde und eine fast ebene Oberfläche hatte. Ob der Findling rituellen Zwecken diente, lässt sich zwar nicht feststellen, aber nicht ausschließen. Alle archäologischen Materialien weisen auf eine Chronologie in der italienischen Endbronzezeit hin, nämlich 1.150–950 v. Chr. [25].


[Die Fußnoten beziehen sich auf die englische Originalfassung, die mit einem Klick erreicht werden kann.]